材料和试剂

LB肉汤（Miller）（Sigma-Aldrich，目录号：MKBS8229V）
沙门氏菌（SL1344）
羧苄青霉素（Goldbio，目录号：4800-94-6）[保存于-20℃的50％水/甲醇（v/v）中的储备溶液100mg/ml]
盐水（氯化钠）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）[0.9％氯化钠的无菌水（w/w）]
过氧化氢[30％（w/w）]（Sigma-Aldrich，目录号：026K3770）
二硫苏糖醇（AMRESCO，目录号：0363C45）（储备溶液1M，保存在-20℃的无菌水中）
pfpv25-roGFP2载体（可通过联系bfinlay@interchange.ubc.ca获得）（van der Heijden等人，2015）
10％甘油的无菌水（v/v）（甘油）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5306）
125ml烧瓶（VWR International，目录号：89090-316）
1.5ml无菌Eppendorf管（VWR International，目录号：89000-028）
10％甘油的无菌水溶液
Luria Broth（请参阅食谱）

设备

具有平底透明的黑色96孔测定板（Corning，Costar ，目录号：3631）
37℃培养箱/摇床（New Brunswick Scientific，型号：M1025-0000）
电穿孔仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2100）
荧光平板读数器（Tecan Trading AG，型号：Infinite M200）或能够在37℃测量96孔板的类似装置，在405nm和480nm激发，在510nm发射
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：spectronic 200）
20-200μl多通道移液管（Rainin，型号：L12 200R）
电穿孔杯（间隙尺寸1mm）（VWR International，目录号：89047-206）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75003424）
10ml玻璃培养管（VWR International，目录号：47729-574）

软件

对于荧光板读取器（Magellan 7）
注意：此软件随附有Tecan荧光板读取器。如果使用不同的平板读数器，与Magellan 7相当的软件可用于荧光测量的数据采集。

程序

创建roGFP2表达菌株
第0天
下午，在1.5％LB琼脂平板上从-80℃甘油储液[25％（v/v）甘油]中条纹细菌靶菌株，并在37℃下孵育过夜（加入适当的抗生素）。
第1天
在下午，从LB平板使用无菌移液器吸头挑选一个单一的殖民地。使用移液器吸头接种玻璃培养管中的5ml LB培养基，并在37℃下生长过夜，同时以225rpm振荡（适当的抗生素）。
第2天
1. 在早晨，从过夜培养物中取150μl，接种5 ml的新鲜LB培养基。在37℃下生长3小时将培养物置于冰上5分钟。
2. 在4,000×g下旋转5ml培养物15分钟，并处理上清液。
3. 通过加入1ml无菌水和悬浮液洗涤沉淀一次的细菌沉淀通过吸移上下数次。转让细菌悬浮液至无菌Eppendorf管中并在14,000×下离心 g 1分钟。弃去上清液。
4. 通过加入1洗涤沉淀 ml无菌甘油溶液[10％（v/v）甘油水溶液]并旋转以14,000in x g 搅拌1分钟。弃去上清液。重复步骤A4。
5. 重悬在50μl甘油溶液中的沉淀，加入2μl的pfpv25-roGFP2质粒DNA（〜50ng /μl总质粒DNA）。
6. 转移细菌溶液到电子比色皿，并转化细菌使用电穿孔（V = 2.5kV）。转移细菌溶液加入到1ml新鲜LB培养基中，并在37℃下振荡孵育1小时在225rpm下接种在含有100μg/ml的LB平板上羧苄青霉素。
第3天
挑取一个菌落并在37℃下在含有100μg/ml羧苄青霉素的玻璃培养管中的5ml LB中生长过夜，然后在第二天通过将1ml细菌培养物与1ml 50％甘油/LB v/v），终浓度为25％甘油并在-80℃下冷冻。
准备测量细菌培养物
第0天
下午，将含有pfpv25-roGFP2质粒和原始靶菌株（不含质粒，因此非荧光）的细菌菌株从含有适当抗生素的LB琼脂平板上的-80℃甘油储液中划线，并在37℃下孵育过夜C。
第1天
在下午，从每个板中挑取单个菌落，并在含有合适抗生素的玻璃培养管中的5ml LB中在37℃振荡（225rpm）下培养细菌过夜。
第2天
1. 在早晨，从每个过夜培养物中取300μl 在125℃对每种细菌培养物接种10ml新鲜LB培养基 ml锥形瓶（未加入抗生素）。
2. 生长3小时（或直到同时在225rpm下摇动。在2,500xg下旋转培养物15分钟，并在5ml盐溶液（0.9％w/w）中洗涤沉淀一次在水里）。
3. 将沉淀重悬在1ml盐水溶液中，并在光谱仪中测定溶液的OD 600。
4. 使用盐水溶液稀释细菌溶液至OD 600 = 2.0。转移100微升细菌生理盐水溶液每孔黑色96孔透明底板。
5. 对于每个荧光菌株，也转移100 μl相同的非荧光菌株（在OD 600 = 2.0），以确定背景荧光。在图1中，板布局的示例是显示。
设置读板器
1. 将Tecan荧光板读数器预温至37℃。 405/480比例将通过两次后续测量获得，其中细菌首先在波长405nm激发，而在510测量发射 nm。在第一次测量后，立即激发细胞再次在480nm处测量，而在510nm处测量发射。两者荧光强度用于计算归一化的405/480nm比率和相应的细菌内氧化还原电位。
2. 这些测量可以重复延长的时间段以实时跟踪细菌内氧化还原电位。
3. 使用以下设置对读板器进行编程：
  1. 温度37℃。
  2. 在每轮测量前振动持续2秒。
  3. 在405nm和480nm下的激发
  4. 在510nm处发射。
  5. 从底部读取。
  6. 由孔确定的增益（表达roGFP2的细菌的最大增殖的65％）
  7. 连续测量30分钟。
  8. 自动生成具有荧光强度的Excel表。
4. 装上装有黑色96孔透明底板的细菌溶液，并连续测量30分钟。该数据将用于确定所有细菌溶液具有相同的细菌内氧化还原电位氧化剂。
5. 当Tecan读板仪测量时，制备含有不同量的过氧化氢的盐溶液 4mM，6mM，8mM，10mM和12mM）。也准备盐溶液用100mM过氧化氢和含2mM DTT的盐溶液。这些溶液用于确定最大氧化405/480比率和最大降低405/480比例。总是准备氢过氧化物溶液。
6. 30分钟后连续测量完成后，再次设置机器，以便它可以立即重新开始连续测量90分钟。只有当 Tecan板读数器是完全准备和编程，快速添加100微升的来自步骤C5的预制的过氧化氢溶液加入到每个孔中。对于此步骤，使用多通道移液器快速样品处理。使用在彼此相邻的孔中相同的过氧化氢浓度（例如A1和A2，B1和B2 等）。加入100微升的100毫米氢过氧化物溶液加入孔G1和G2，并加入100μl的2mM DTT 溶液加入也在步骤C5中预制备的孔H1和H2中。在加入过氧化氢和DTT后立即开始测量。细菌将迅速解毒过氧化氢 90分钟后（或更早取决于实验设置）可以重复加入过氧化氢用于随后的挑战。
  
  图1. 96孔成像板的示例布局。在泳道1中细菌表达roGFP2，而泳道2包含空载体以确定背景荧光（BG）每个条件。两个相邻的井，例如A1和A2经历用氧化剂进行相同的攻击。在G行中，100mM的氢加入过氧化物，这些结果用作最大氧化值用于归一化。在H行中，加入10mM DTT，这些结果是用作归一化的最大减小值。
数据分析
首先，我们计算S的比率（405/480nm）。 typhimurium 使用公式1为每个时间点。为了更好地解释这种计算，我们使用了图1的布局。对于从第1列孔中获得的每个荧光强度，从第2列的相应孔中减去背景荧光。在方程1中，我们已经从图1中指示了相应的孔括号以更好地解释计算。

在使用等式1计算R em之后，使用等式2将其归一化为最大氧化值和最大值减小的405/480值以获得更好的可比性。最大氧化比（ R _ox）通过使用如上所述的等式1从孔H1的荧光计算从孔G1的荧光计算的最大减小的比率（ R red 。在归一化之后，由归一化的标准化的氧化物的上限为1.0，而由 R 给出的归约的下限> _正常化为0.1

可以在图中绘制每个时间点的 R _标准化，以获得关于细菌内氧化还原电位变化的实时报告。典型的结果可以在图2中看到。在该图中，向上的箭头表示用1mM H 2 O 2 Sub 2的挑战。
使用roGFP2（-280mV）的中点电位， R ， _{/em> _ox可用于计算 S内的实际E _roGFP2。 typhimurium 。该计算先前已经描述过（Gutscher等人，2008; van der Heijden等人，2015）。除了 R ， R _红色和 R _{ox 我们需要在还原或氧化条件下在480nm处的荧光强度（ max 480分钟）。使用这些值，我们计算由等式3给出的roGFP 2氧化的程度（OxD roGFP2 ）。

然后可以使用氧化度来通过使用等式4计算细胞内传感器氧化还原电位E subGFP2。

其中R是气体常数（8.315JK < - sup-mol ^-1），T是绝对温度（310.15K），z是转移电子数，2008），F是法拉第常数（96,485℃ mol ^-1）。 roGFP2的中点电位（E ^{roGFP2 ）为-280mV（Hanson等人，2004）。}}}

代表数据

图2.实时细菌内氧化还原电位。鼠伤寒沙门氏菌。每个向上箭头表示用过氧化氢攻击。

笔记

重要的是先在LB上平板细菌，而不是直接从-80℃甘油原液开始液体培养。这可以基本上改变细菌群体的适应性，并因此影响你的最终结果。
在该方案中，使用晚指数生长期的细菌，但是也可以使用任何其他生长期的细菌。在一个实验中，对照菌株应生长至相同的生长期
为了保持随后的荧光读数足够频繁以精确监测细菌内氧化还原电位，建议从不读取超过36个孔每个实验。
为了测量其它革兰氏阴性细菌中的细菌内氧化还原电位，可以将roGFP2基因克隆到用于组成型启动子下选择的细菌的合适载体中。在pfpv25-roGFP2载体中，roGFP2基因处于RpsM核糖体启动子（沙门氏菌启动子）的控制下。推荐高度表达的基因的启动子允许高表达和显着的荧光信号。对于不同的靶菌株，必须选择允许在各自的靶菌株中高水平组成型表达的启动子
由于将100μl的过氧化氢溶液加入黑色96孔透明底板中的细菌溶液中，过氧化氢的终浓度将是过氧化氢溶液浓度的一半。

食谱

Luria肉汤
25g LB肉汤（Miller）/L无菌水

致谢

这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）的经营资助。 B.B.F. 是不列颠哥伦比亚大学Peter Wall杰出教授。这项工作没有竞争利益。该协议改编自我们实验室的先前工作（van der Heijden等人，2015）。我们真诚地感谢俄勒冈大学的James Remington博士提供原始的pRSETB roGFP2构建体。

参考文献

Gutscher，M.，Pauleau，A.L.，Marty，L.，Brach，T.，Wabnitz，G.H.，Samstag，Y.，Meyer，A.J.and Dick，T.P。（2008）。细胞内谷胱甘肽氧化还原电位的实时成像。/em> 5（6）：553-559。
Hanson，G.T.，Aggeler，R.，Oglesbee，D.，Cannon，M.，Capaldi，R.A.，Tsien，R.Y。和Remington，S.J。（2004）。用氧化还原敏感性绿色荧光蛋白指示剂调查线粒体氧化还原电位。 Biol Chem 279（13）：13044-13053
Hoiseth，S.K。和Stocker，B.A。（1981）。芳香依赖型沙门氏菌typhimurium 是非毒性的，有效的活疫苗。 Nature 291（5812）：238-239。
Imlay，J.A。（2013）。氧化应激的分子机制和生理后果：来自模型细菌的教训 < em> Nat Rev Microbiol 11（7）：443-454。
van der Heijden，J.，Bosman，E.S.，Reynolds，L.A。和Finlay，B.B。（2015）。直接测量巨噬细胞内沙门氏菌的氧化和亚硝化胁迫动力学。 Natl Acad Sci USA 111（2）：560-565。