材料和试剂

金黄色葡萄球菌
不含右旋糖的细菌胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（BD Diagnostic Systems，目录号：DF0862178）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷（CMH）（Noxygen Science Transfer& Diagnostics GmbH，目录号：NOX-2.2-100mg）
超氧化物歧化酶（SOD）（Sigma-Aldrich，目录号：S7571）
二甲基硫脲（DMTU）（Sigma-Aldrich，目录号：D188700）
Critoseal（Thermo Fisher Scientific，目录号：0267620）
5μMDETC（Noxygen，目录号：NOX-10.1）
25μM去铁胺（Noxygen，目录号：NOX-10.1）
培养瓶（250ml）
文化管
1.5 ml Eppendorf管
Krebs-HEPES缓冲液（KDD缓冲液）（见配方）

设备

37℃摇床培养箱（250rpm/min）
Leica Biosystems Critoseal毛细管密封胶（Leica Microsystems，目录号：MS215003A）
Bruker e-Scan EPR光谱仪和Noxygen温度控制器Bio-I（Bruker，型号：NOX-E.11-ESR）
微量移液器（50μl，EPR管）（Noxygen Science Transfer& Diagnostics GmbH，目录号：MS215003A）
分光光度计
Vortex-Genie 2

软件

Bruker WinEPR数据处理软件

程序

为了获得起子培养物，接种单个集落的S.金黄色葡萄球菌注射到补充有14mM葡萄糖的3ml无菌TSB中，并在调节至250rpm的37℃摇床培养箱中孵育过夜。
在具有起始培养物的250ml烧瓶中接种25ml无菌TSB（用35mM葡萄糖补充）至0.06的最终OD 600，并在37℃摇床培养箱中孵育，调节至250rpm， 72小时。
72小时孵育期后，在1.5ml Eppendorf管中收获10OD 600单位（〜7×10 9 supu cfu/ml），并悬浮于1ml冰中冷KDD缓冲液。将细菌悬浮液置于冰上直至进一步使用
在EPR测量之前，将ROS敏感的自旋探针CMH（在KDD缓冲液中制备的工作母液〜4mM）在1ml细菌悬浮液（步骤3）中添加至200μM的最终浓度，短暂涡旋（2秒），并允许在室温下放置15分钟
然后通过毛细管作用将细菌悬浮液（50μl）转移到微量移液管中，并在EPR分析前立即使用Critoseal在末端密封。
EPR采集参数如下：场扫描宽度，60高斯;微波频率，9.75kHz;微波功率，21.9mW;调制幅度，2.37高斯;转换时间，10.24 ms;时间常数，40.96 ms。
记录2-D光谱和每个样品的平均10次扫描，以减少背景噪声。 EPR光谱和基线校正的定量可以使用Bruker WinEPR数据处理软件实现
为了鉴定超氧化物（O 2 2-）和羟基自由基（OH - ）对总体EPR光谱的贡献，SOD（400单位），O 2 2-清除抗氧化剂可在加入CMH之前向细菌悬浮液（步骤3）中加入酶和/或DMTU（20mM），OH·清除剂，并在室温下温育15分钟。继续执行本协议的第4步。
注意：当获取EPR信号时，具有阴性对照（步骤4;含有200μMCMH的KDD缓冲液）是至关重要的。该控制将报告在实验期间CMH已经经历的自氧化程度。

代表数据

A ; ; B

图1. S的EPR检测。 aureus ROS的产生。 A.接种。金黄色葡萄球菌到0.06的初始OD 600，培养物有氧培养（培养瓶：体积比= 10:1,250rpm）。在细菌生长的3小时，24小时和72小时撤回用于EPR分析的培养物样品。 B. 在加入自旋探针CMH之前用400单位的SOD，20mM DMTU或载体（野生型，WT）处理金黄色葡萄球菌培养物样品（72小时）。测定KDD缓冲液（蓝线）中CMH自动氧化的基础程度作为对照。

食谱

Krebs-HEPES缓冲液（KDD缓冲液）（pH7.4） 99 mM NaCl
4.69mM KCl
2.5mM CaCl 2·h/v 1.2mM MgSO 4 25mM NaHCO 3/v/v 1.03mM KH 2 PO 4 sub/
5.6mM D-葡萄糖 20 mM HEPES
5μMDETC
25μM去铁胺

致谢

这项工作由NIH拨款资助。 R01-A1038901（KWB），PO1-AI083211（KWB），R01- HL103942（MCZ）和美国心脏协会博士后团契12POST12080155（VCT）。 EPR光谱学核心部分地由授予内布拉斯加大学氧化还原生物学中心的NIH生物医学研究优秀中心（COBRE）资助（1P30GM103335-01）支持。该协议改编自托马斯（Thomas）等人（2014）和托马斯（Thomas）等人（2010）。

参考文献

Thomas，VC，Kinkead，LC，Janssen，A.，Schaeffer，CR，Woods，KM，Lindgren，JK，Peaster，JM，Chaudhari，SS，Sadykov，M.，Jones，J.，AbdelGhani，SM，Zimmerman，MC ，Bayles，KW，Somerville，GA 和Fey，P.D。（2013）。功能障碍的三羧酸循环增强β-内酰胺表皮葡萄球菌的适应性压力。 MBio 4（4）。
Thomas，V.C.，Sadykov，M.R.，Chaudhari，S.S.，Jones，J.，Endres，J.L.，Widhelm，T.J.，Ahn，J.S.Jawa，R.S.，Zimmerman，M.C.and Bayles，K.W。碳溢出途径在调节细菌细胞死亡中的核心作用 < em> PLoS Pathog 10（6）：e1004205。