材料和试剂

Transwell插入0.4μM（BD Biosciences，目录号：353493）
注意：目前为"Corning，Falcon?，目录号：353493"。
无菌15 ml离心管
20μl和1 ml提示
6孔细胞培养板（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3516-50EA）中。
THP-1细胞（ATCC，目录号：ATCC TIB-202 ^TM）
胎牛血清（500ml）（通过制造热灭活）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10500064）
青霉素/链霉素溶液（100x）稳定（100ml）（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
Dulbeccos PBS（1x）w/o Ca 2+或Mg 2+（500ml）（Sigma-Aldrich，目录号：PBS2541）
胰蛋白酶-EDTA（1x）（100ml）（Sigma-Aldrich，目录号：T3924-100ml）
EDTA二钠盐ARE（500gm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：FKCF/0700/53）
DMEM w/L-谷氨酰胺，丙酮酸&碳酸氢钠（500ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D6429-24x）
RPMI 1640w/L-谷氨酰胺 - 碳酸氢盐（500ml）（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）
重组人干扰素型γ（IFN-γ）（Peprotech，目录号：300-02）
重组人白介素4（IL-4）（Peprotech，目录号：200-04）
重组人白细胞介素13（IL-13）（Peprotech，目录号：200-13）
来自大肠杆菌的脂多糖（Sigma-Aldrich，目录号：L2630）
DMEM/FCS介质（参见配方）
RPMI/FCS介质（参见配方）
IL4储备溶液（见配方）
IL13储备溶液（见配方）
IFN-γ储备溶液（见配方）
PMA（参见配方）
LPS（见配方）

设备

台式离心机
吸气器
血细胞计数器
组织培养罩
CO <2>孵化器

程序

协议示意图
下面是显示协议步骤的简要概述和指示所有在无菌条件下进行的事件顺序的时间线。

图1.程序的示意图。将THP-1细胞（黄色）置于插入物中，在那里它们被PMA激活;加入LPS诱导M1巨噬细胞（M1MΦ），IL4/IL13诱导M2MΦ分化（绿细胞）。

第1天
THP-1细胞在RPMI/FCS培养基中的悬浮液中生长，并且一旦接种到transwell插入物中就进行激活。使用手套在插入件的无菌边缘处处理插入件。

使用血细胞计数器计数THP-1细胞，制备浓度为1×10 5个细胞/ml的细胞悬液。
然后通过加入2ml RPMI/FCS培养基制备一个6孔板每6孔。然后将transwell插入物放入6孔中含有2ml培养基。
将2ml的THP-1细胞悬浮液加入到插入物中（2×10 5个细胞/插入物）。
一旦沉降的THP-1细胞立即用10ng/ml的 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（PMA）处理24小时（1μl原液溶液加入4ml总体积），如图1第1天所述。

第2天
在PMA中24小时后，在transwell插入物中分化活化的THP-1细胞。

通过加入2ml新鲜的RPMI/FCS培养基制备新的6孔板
然后从插入物中轻轻地吸出含有PMA的培养基含有活化的THP-1细胞并转移插入片段新的6孔板如图1第2天所述。
然后将2ml RPMI/FCS培养基加入到插入物中，并在处理前放置1小时
然后用所需的细胞因子混合物处理插入物：
1. M1分化可以通过用15ng/ml处理来实现的脂多糖（LPS）（1.5μl储备液加入4ml）或50μl ng/ml IFN-γ（2μl储备液加入4ml）
2. M2 可以通过用25ng/ml的联合治疗实现分化 IL4和25ng/ml IL13（1μl储备液加入4ml）中
3. 未分化但活化的THP-1细胞未经处理插入用作激活的参考孔，但是非分化的单核细胞。
4. 正确分化为M1 和M2型巨噬细胞可以在这个阶段评估免疫荧光，ELISA或基因表达分析标记（如IL1，IL10，ARGINASE），如Smith等人（2014）中所述。

第3天
将待研究的人黑素瘤细胞系预铺板到6孔板中。黑素瘤细胞是粘附的，并且通常在DMEM/FCS培养基中生长。例如，WM266-4细胞以2×10 5个/插入物接种72小时共培养实验。

黑色素瘤细胞在5ml PBS/EDTA中洗涤一次
在PBS/EDTA吸出后，向烧瓶中加入1ml胰蛋白酶/EDTA，然后在37℃培养箱中温育3-5分钟。
然后将细胞重悬于10ml DMEM或RPMI（取决于细胞系）培养基中，然后计数
取决于使用的细胞系的倍增速率和长度进行的实验中，铺板的细胞数目将变化通常位于每6孔0.5-2×10 5个细胞的区域内（2ml / 好）。

第4天
通过在如图1所述的相同板中组合分化的巨噬细胞和黑素瘤细胞来建立共培养物第4天。

48小时后加入LPS或IL4/IL23，分化将THP-1细胞在新鲜RPMI/FCS培养基中洗涤3次。一次洗包括小心抽吸的媒体，然后加入4毫升新鲜RPMI/FCS培养基
然后使用手套拿起插入物 ?并转移到黑色素瘤细胞培养物的顶部加入2ml DMEM或RPMI（取决于黑素瘤细胞系）媒体插入插页注意：一旦转移，transwell测定然后准备用于几种体外测定例如药物治疗后存活分析或基因表达分析共培养时间（Smith等，2014）。细胞可以保存在这里共培养情况下再培养96小时。这种共同文化技术允许隔离和研究两种群体细胞。 RNA或蛋白质裂解物可以从中获得粘附黑素瘤细胞在孔底，另外巨噬细胞可以通过分离插入物单独裂解。

代表数据

图2.与分化的巨噬细胞共培养的黑素瘤细胞的细胞数量评估。已经与M1和M2巨噬细胞共培养5天的WM266-4黑素瘤细胞的结晶紫染色。在移除插入物之后，用4％甲醛/PBS（15分钟）固定细胞，用0.5％结晶紫/PBS（1小时）染色，然后用水洗涤直至洗涤水澄清。结晶紫非常有效地染色细胞，并且可以通过在染料溶解后计数或光密度（OD540）测量来评估细胞/集落数。该步骤不需要无菌条件。

笔记

使用该transwell技术产生可靠且一致的结果的最关键的因素是选择用于电镀的各个黑素瘤细胞系的正确数目，使得它们在实验的终点不过度生长。由于在井上方处理插入物也存在增加的污染风险，这可以通过尽可能迅速和清洁地工作来减少。

食谱

DMEM/FCS介质
补充有1％青霉素 - 链霉素溶液和10％FCS的Dulbecco改良的Eagle培养基
RPMI/FCS媒体
补充有1％青霉素 - 链霉素溶液和10％FCS的RPMI
IL4储备液
在无菌PBS 0.05％BSA中补加至100μg/μl，并等分并保存在-80℃下
IL13储备液
在无菌PBS 0.05％BSA中补加至100μg/μl，并等分并保存在-80℃下
IFN-γ储备液
在无菌PBS 0.05％BSA中补加至100μg/μl，并等分并保存在-80℃下
PMA
在无菌PBS中稀释至浓度为40μg/μl，然后等分并储存在-20℃下
LPS
在无菌PBS中稀释至浓度为40μg/μl，然后等分并储存在-20℃下

致谢

THP-1分化方案和该系统的开发是在Nadia Lunheshi和Richard Sainson在Medimmune Ltd，UK的指导下进行的。该研究的资金由授予C.Weborbrock的CRUK C11591/A16416提供。该协议在Smith等人（2014）中开发和使用。

参考文献

Smith，MP，Sanchez-Laorden，B.，O'Brien，K.，Brunton，H.，Ferguson，J.，Young，H.，Dhomen，N.，Flaherty，KT，Frederick，DT，Cooper，ZA， Wargo，JA，Marais，R.and Wellbrock，C。（2014）。免疫微环境通过巨噬细胞衍生的TNFα赋予对MAPK通路抑制剂的抗性。 Cancer Discov 4（10）：1214-1229。
Tsuchiya，S.，Yamabe，M.，Yamaguchi，Y.，Kobayashi，Y.，Konno，T.and Tada，K。（1980）。人类急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）的建立和表征。 Int J Cancer 26（2）：171-176