材料和试剂

T25烧瓶（Coring，Falcon ，目录号：353108）
T75烧瓶（Coring，Falcon ^®，目录号：353136）
15ml离心管（Coring，Falcon ，目录号：352096）
96孔板（Coring，目录号：3799）
FACS管
肿瘤细胞系（在烧瓶中，在37℃和5％CO 2培养箱中生长）
RPMI 1640（EuroClone，目录号：ECM9106L）
在56℃热灭活1小时的胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
青霉素/链霉素（EuroClone，目录号：ECB3001D）
L-谷氨酸（EuroClone，目录号：ECB3000D）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（EuroClone，目录号：ECB4004L）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153-100G）
台盼蓝
KIR-Fc融合蛋白质

重组人KIR2DL1/CD158a Fc嵌合体蛋白（R& D系统，目录号：1844-KR-050）
重组人KIR2DL3/CD158b2 Fc嵌合蛋白（R& D系统，目录号：2014-KR-050）
重组人KIR3DL1 Fc嵌合体蛋白（R& D System，目录号：1225-KR-050）

山羊抗人类分子探针二抗，RPE偶联物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：H10104）
完成RPMI（参见配方）
833μMEDTA（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

离心机，使用最大加速和减速（Eppendorf，型号：5810R）
将培养箱（5％CO 2，37℃）（Forma TM Supter-Cult TM CO 2 Sub培养箱 - Thermo Fisher Scientific）
流式细胞仪，配有2个激光器（8个检测器），通过使用DIVA软件版本6.1.3（BD，型号：FACSCanto II）与PC接口，

软件

DIVA软件版本6.1.3
FlowJo软件

程序

将人肿瘤细胞在37℃，5％CO 2的培养箱中在新鲜RPMI培养基中以细胞密度≥0.5-0.7×10 6个细胞/ml培养。对于每个实验需要0.5×10 6个肿瘤细胞
用PBS（5ml）洗涤贴壁细胞并通过加入833μMEDTA（1ml的T25烧瓶和2ml的T75烧瓶）在37℃，5％CO 2的培养箱中3-5分钟。
通过在468×g离心7分钟，用PBS（2×5ml，在15ml管中）洗涤细胞两次，并将它们重悬在冷的FACS缓冲液中。
用台盼蓝排除法计数总活细胞数
在圆底96孔板中以1×10 6个细胞/孔的细胞密度接种细胞。准备1个孔用于对照（无KIR-Fc融合蛋白），1个孔用于待测试的每个融合蛋白。
在4℃下以832×10 9 /分钟的速度旋转细胞2分钟。
弃去上清液，加入100μl/孔的冷FACS缓冲液，其含有以1:5稀释的单一KIR-Fc融合蛋白（KIR2DL1-Fc，KIR2DL3-Fc和KIR3DL1-Fc）和100μl冷FACS缓冲液，。
在4℃孵育1小时。
用150μl冷FACS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下以832×g离心。
弃去上清液并将细胞重悬于50μl含有山羊抗人二抗，RPE偶联物抗体（1:100稀释）的冷FACS缓冲液中，小心混合以避免形成气泡。
在冰上在黑暗中孵育25分钟。
用150μl冷FACS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下以832×g离心。
丢弃上清液和重悬浮的细胞在150μlFACS管中的冷FACS缓冲液，并执行流式细胞术分析。通过在前向散射对侧向散射点图中选通来选择存活的人单个细胞，并通过平均荧光强度评估KIR-Fc融合蛋白的结合（图1）。
使用DIVA软件获取数据，并使用FlowJo软件进行分析

图1.KIR3DL1结合DAOY细胞。 KIR3DL1-Fc融合蛋白与DAOY细胞结合的流式细胞术分析（蓝线）。同种型匹配的阴性对照抗体显示为红色线。

食谱

完成RPMI
440ml RPMI 1640
50ml FBS
5ml青霉素 - 链霉素 5ml L-谷氨酰胺
833μMEDTA
将7.3g EDTA溶于50ml无菌水中，调节pH至8.0 将83.3μl的该溶液加入到50ml无菌PBS中通过20μm过滤器过滤灭菌
存储在4°C
FACS缓冲区
50 ml PBS
1 g BSA

致谢

此协议改编自Cifaldi等人。（2015）。我们承认意大利卫生部（意大利罗马）的资金和5 x 1,000意大利意大利安哥拉（意大利米兰）的特别项目。

参考文献

Cifaldi，L.，Romania，P.，Falco，M.，Lorenzi，S.，Meazza，R.，Petrini，S.，Andreani，M.，Pende，D.，Locatelli，F.and Fruci， 2015）。 ERAP1调节自然杀伤细胞功能，通过控制抑制性受体的结合。 Cancer Res 75（5）：824-834
Lanier，LL（2005）。 NK细胞识别。/a> Annu Rev Immunol 23：225-274
Raulet，DH，Vance，RE和McMahon，CW（2001）。自然杀伤细胞受体库的调节。 Annu Rev Immunol 19：291-330。