材料和试剂

培养皿（35毫米）（Tarsons，目录号：460035）
显微镜玻璃片
胶或指甲油
Whatman滤纸No.1（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：09-805）
琥珀Eppendorf（容量：2毫升）（Tarsons，目录号：500013）
玻璃管
管（容量：15ml和50ml）（Tarsons，目录号：546021 [15ml]; 546041 [50ml]）
一次性比色皿（Sigma-Aldrich，目录号：Z330361）
注意：本产品已停产。
14日龄新鲜水稻幼苗的叶子
柠檬酸三钠二水合物（HiMedia Laboratories，目录号：RM1415）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
绝对乙醇
活性炭（HiMedia Laboratories，目录号：PCT1001）
三氯乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
液氮
30％过氧化氢溶液（H 2 O 2 O 2）（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
盐酸（HCl）（Molychem，目录号：23540）
二氨基联苯胺（DAB）（Sigma-Aldrich，目录号：D8001）
硝基四唑（NBT）（HiMedia Laboratories，目录号：MB107）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2）
2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H 2 N 2 DCFDA）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：D399）}
二甲基亚砜（最小测定：99.0％）（S D Fine-Chem，目录号：38216）
硫酸亚铁（HiMedia Laboratories，目录号：GRM1026）
硫酸（HiMedia Laboratories，目录号：AS016）
二甲苯酚橙（LobaChemie，目录号：06507）
甲醇（HPLC级）（Minimun测定：99.7％）（HiMedia Laboratories，目录号：AS061）
丁基化羟基甲苯（HiMedia Laboratories，目录号：GRM797）
NBT解决方案（见配方）
DAB解决方案（请参阅配方）
H 2 2 DCFDA溶液（参见食谱）
亚铁氧化 - 二甲苯酚橙（FOX）试剂（见食谱）
标准H 2 O 2解决方案（参见食谱）

设备

移液器（康宁，型号：Lambda Plus）
真空渗透设备（与真空泵连接的Dessicator）（真空泵：Rocker 300，Rocker Scientific，型号：Rocker 300）; Dessicator真空：tarsons 403010 [Tarsons，型号：403010]）
水浴（Polyscience，型号：WB02S）
立体显微镜（Olympus，型号：SZ61）
共焦显微镜（Nikon A1R，激光扫描共焦显微镜系统）
离心机（REMI，型号：C-24 PLUS）
分光光度计（PerkinElmer，型号：Lambda 25）
注意：本产品已停产。
称重平衡（公民规模，型号：CY220）
pH计（Systronics，型号：μ361）
杵砂浆

程序

NBT测定（用于检测O ^{2 -}）（视频1）

<！ - flashid2061v145开始 - >
视频1.使用NBT测定在水稻中定性估计超氧化物离子（O2-）的程序

<！ - flashid2061v145结束 - >
1. 将茎的基部的水稻幼苗的第二叶切成小块（约1厘米）（图1）
  
  图1.长度约1厘米的水稻幼苗片
2. 立刻蘸碎片将样品冷却并浸入20％甘油中
3. 将样本保留在幻灯片上，使用立体显微镜捕获图像
4. 深蓝色的外观表示O ^{2 -}的存在（图3）。
DAB测定（用于检测H 2 O 2 O 2）
1. 将茎的基部的水稻幼苗的第二叶切成小块（约1厘米）
2. 将切片立即放入使用镊子的培养皿（35mm）中在双蒸水（2ml）（pH = 3.8）中制备的DAB溶液（1mg/ml）中。
3. 真空在60KPa压力下浸渍浸渍的样品10分钟，然后在室温下室温孵育10分钟。
  注意：如果没有真空浸渗装置，请在室温下轻轻浸泡并孵育样品8小时。
4. 孵育后，将样品浸在无水乙醇中，然后将其保存在水浴（100℃）中，直到完全从样品中除去叶绿素（通常在2小时内）。
5. 将样品冷却并浸入20％甘油中
6. 使用立体显微镜拍摄图像，方法是将样本保存在幻灯片上。
7. 褐色产品的外观表示存在H 2 O 2 O 2（图4）。
H 2 O 2 DCFDA测定（用于检测H 2 O 2 O 2）
1. 将茎的基部的水稻幼苗的第二叶切成小块（约1厘米）
2. 使用镊子将切片立即浸入培养皿（35 mm）的10μMH 2 N 2 DCFDA溶液中。
3. 真空在60KPa压力下浸渍浸渍样品5分钟，然后在室温下在黑暗中孵育10分钟。
  注意：如果没有真空渗透装置，请将样品在室温下浸泡2小时。
4. 孵化后，用高压灭菌双蒸水将样品三次洗涤三次
5. 洗涤后将样品浸入20％甘油。
6. 对于共聚焦分析，将样品放在载玻片上，并使用指甲油或胶水将薄的盖子滑过其上
7. 使用激光波长488 nm的激光束在共聚焦显微镜下观察样品
8. 绿色荧光指示H 2 O 2 O 2的存在，红色表示叶绿素的自发荧光。
含水H 2 O 2含量的量化
1. 用0.5ml 5％三氯乙酸制备的活性炭（0.1g）中的0.5g新鲜幼苗均匀，使用研杵和用液氮的研钵。
2. 使用Whatman过滤器（1号）过滤匀浆物，并将滤液收集在2ml琥珀色的Eppendorf管中（H 2 O 2 O 2光敏）。
3. 将滤液以5,000×g离心管中10分钟。
  注意：将两个2ml Eppendorf管中的一个样品的滤液离心，然后将上清液一起或使用5ml琥珀色的Eppendorf管。
4. 在玻璃管中收集0.2ml上清液，并向其中加入1ml FOX试剂
5. 混合反应混合物，室温孵育15分钟
6. 通过使用一次性塑料比杯记录560nm处的吸光度并使用标准曲线计算浓度来估算H 2 O 2 O 2水溶液的含量。
7. 浓度使用啤酒 - 朗伯定律计算，即。
  A =εx b x c
  哪里，
  A =吸光度，
  ε是波长依赖的摩尔吸光系数，
  b =路径长度，
  c =浓度
8. 对于标准曲线制备，取0.2ml不同浓度的H 2 O 2 O 2，加入1ml FOX试剂，并与样品相似（参见方案5）。
  注意：吸光度应在560 nm波长下进行。

数据分析

NBT分析
观察：深蓝色的外观表示存在O ^{2 -}（图3）。

图3.水稻NBT测定的立体显微镜图像，显示存在蓝色甲状结晶表明的超氧化物离子（O ^{2 -}）。 A.阴性对照; B.显示超氧化物离子存在的水稻样品（O ^{2 -}）
DAB分析
观察：褐色产品的外观表示H 2 O 2 O 2的存在（图4）。

图4.显示存在由棕色产品表示的过氧化氢（H 2 O 2 O 2）的水稻的DAB测定的立体显微镜图像。强> A.负控制; B.显示过氧化氢（H 2 O 2 O 2）存在的水稻样品。
H 2 DCFDA分析
观察：绿色荧光表明存在H 2 O 2 O 2，红色表示叶绿素的自动荧光（图5）。

图5.共聚焦H 2 DCFDA染色图像。 1.红色表示叶绿素;绿色表示ROS主要是过氧化氢; 3.覆盖ROS和叶绿素。

笔记

DAB仅在酸性pH（pH = 3.8）下溶解在双蒸水中，所以在添加DAB之前，用HCl设定pH值。解散需要一点时间。
在H 2 O 2 DCFDA测定期间，样品应最低限度地暴露于光。
在二级DCFDA曝光后，立即进行共焦显微镜检查。
所有用于过氧化氢水溶液估算的溶液应该是新鲜的，应在2小时内使用

食谱

NBT解决方案
在10mM柠檬酸钠（pH = 6）中制备的6mM NBT
使用1N HCl或1N NaOH调节pH值
DAB解决方案
在高压灭菌的双蒸水（pH = 3.8）中制备1mg/ml DAB溶液使用1N HCl调节pH值
H 2/2 DCFDA溶液
在二甲基亚砜（DMSO）中制备10mM H 2 DCFDA
使用高压蒸馏双蒸水将其稀释至10μM
亚铁氧化 - 二甲苯酚橙（FOX）试剂（见表1）
准备以下股票解决方案：
试剂a：在2.5M硫酸中制备的25mM硫酸亚铁铵// 试剂b：在HPLC级甲醇中制备的0.25M二甲苯酚橙试剂c：在90ml HPLC级甲醇中制备9.69mg丁基化羟基甲苯
表1. FOX试剂的制备

库存解决方案
卷

试剂一个
1 ml

试剂b
50μl

试剂c
90 ml

高压灭菌双蒸水
8.95 ml

总计
100 ml

标准H 2 O 2 解决方案

5％三氯乙酸（TCA）溶液
将5g TCA溶于100ml的高压灭菌双蒸水中
在5％三氯乙酸中的100μMH 2 O 2种储备溶液

标准H 2 O 2溶液（参见表2）
注意：

不同浓度的H 2 O 2 O 2应该在5％三氯乙酸中制备。
用于制备标准曲线的浓度范围取决于给定样品中存在的过氧化氢含量的范围。

表2.标准H 2 O _{2 的制备 sub> 解决方案集中
2 2 （以μM计）
H ₂ O ₂
从库存（以μl计）使用
要使用的TCA的数量
从库存（以磅计）
FOX试剂
（以ml为单位）

空白
0
200
1

10
20
180
1

20
40
160
1

30
60
140
1

40
80
120
1

50
100
100
1

60
120
80
1

70
140
60
1

80
160
40
1

90
180
20
1

100
200
0
1}

致谢

该协议已经从DeLong等人采用和修改。（2003），Kristiasen等人。（2009）和Wu等人。（2010）。作者承认印度政府生物技术部（DBT）的财政支持（项目号：BT/PR13965/BRB/10/883/2010）。

参考文献

DeLong，JM，Prange，RK，Hodges，DM，Forney，CF，Bishop，MC和Quilliam，M。（2002）。使用修饰的亚铁氧化二甲苯酚橙（FOX）测定法检测植物组织中的脂质氢过氧化物。 em> 50（2）：248-254。
Kaur，N.，Dhawan，M.，Sharma，I。和Pati，PK（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/peter/27286833"target ="_ blank">水稻盐敏感和耐盐品种中活性氧产生和清除系统的相互依赖关系。BMC Plant Biol 16（1）：131。
Kristiansen，KA，Jensen，PE，Moller，IM and Schulz，A。（2009）。通过使用荧光探针CM-H（2'）DCFDA和共聚焦激光显微镜监测活细胞中活性氧的形成和定位。 Physiol Plant 136（4）：369-383。
Wu，GL，Cui，J.，Tao，L.and Yang，H。（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/普罗米特/19644752"target ="_ blank">氟吡虫啉通过在水稻（Oryza sativa）中产生超氧化物和过氧化氢来触发氧化损伤。生态毒理学 19（1）：124-132。