材料和试剂

100毫米盘
PDAC细胞或其他粘附细胞
冷PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
液氮
Turbo DNAse（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM2239）
蛋白G Dynabeads（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：10004D）}
用于免疫沉淀的RBP多克隆hnRNP I抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-16547）
RNAse I（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM2295）}
Bradford解决方案（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1（Sigma-Aldrich，目录号：P3803）
乙醇（VWR，目录号：20821.321）
Trizol（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596018）
氯仿（Honeywell International，Riedel-de Haen，目录号：32211）
异丙醇（CARLO ERBA试剂，目录号：415156）
琼脂糖（Lonza，目录号：50004）
水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
cDNA合成试剂盒（Promega，目录号：M1705）
Tris（VWR，目录号：0826）
氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：27810.364）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
NP-40（Alfa Aesar，Affymetrix/USB，目录号：J19628）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
RNase抑制剂（Promega，目录号：N2511）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
蛋白酶K（Roche Molecular Systems，目录号：3115836001）
DEPC（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
XQuantitative实时PCR试剂盒（LightCycler 480 SYBR Green I Master）（Roche Molecular Systems，目录号：04887352001）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
偏钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：72060）
裂解缓冲液（见配方）
高盐缓冲液（见配方）
3 M醋酸钠（pH 5.2）（见配方）
Laemmli缓冲液（2x）（参见食谱）
蛋白酶K缓冲液（参见食谱）

设备

离心机
UV交联剂（Uvitec，型号：CL 508）
SDS-PAGE和PVDF /硝酸纤维素转移装置（Bio-Rad Laboratories）
变性琼脂糖凝胶仪（Bio-Rad Laboratories）
磁性支架（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）
Thermoblock
定量实时PCR（Roche Molecular Systems，型号：LightCycler 480）
超声波仪（Hielscher ultrasonics，型号：UP200S）

程序

细胞培养制备和UV交联
1. 生长粘附的PDAC细胞，直到达到70-80％汇合。通常每个免疫沉淀（IP）使用5-10×10 6个细胞。
2. 舍弃介质并用冷PBS洗一次。在100毫米细胞培养培养皿（约1毫升/厘米2）中加入4-5毫升PBS。
3. 将盘放在没有盖子的冰上。以400 mJ/cm 2的速度辐射一次（参见图1）。
注意：紫外线照射会产生与蛋白质接触的共价结合。使用的能量水平取决于芳香酸的可用性。这种共价结合允许在严格条件下纯化RBP/RNA复合物。紫外线照射的选择应设定为允许纯化对照RNA的最小照射。

图1.紫外线交联进行UV交联以将蛋白质与共价RNA结合。在照射期间，将盘保持在冰上以最小化加热。
1. 取出PBS，并加入0.5毫升裂解缓冲液至100毫米皿中。
  注意：不要超过裂解缓冲液。
2. 或者，在冷PBS中轻轻刮掉细胞。在4℃下以300×g离心5分钟。丢弃上清液，将颗粒快速冻结在液氮中，并储存在-80°C
细胞裂解
1. 将细胞轻轻地悬浮在裂解缓冲液中，并将悬浮细胞转移到1.5ml离心管中，并在冰上超声处理[Set：Amplitude（％）at 100 and Cycle at 1]（见图2）。
  注意：细胞倾向于在裂解缓冲液中聚集。需要超声处理完成溶解细胞聚集体。通常5秒就够了
  
  图2.细胞超声处理进行超声处理以溶解细胞聚集体。超声处理时，将管保持在冰中，以使蛋白质变性最小化
2. 在冰上孵育细胞10分钟。
3. 每毫升Turbo DNAse样品中加入5μl。在37℃下孵育3分钟。
4. 在4℃下以15,000 x g离心3分钟。
5. 收集上清液（细胞提取物），稀释样品至裂解缓冲液中1 mg/ml，并储存在冰中。
  注意：裂解缓冲液组合物干扰了Bradford测定。不超过1微升的细胞提取物应加入1毫升Bradford溶液。
RNA片段化和RBP免疫沉淀
每个IP使用10μl蛋白G Dynabeads。
1. 用500μl裂解缓冲液洗涤蛋白G Dynabeads并混合悬浮液。将含有悬浮液的管置于磁性支架上，取出上清液。重复此步骤3次。
2. 将蛋白G Dynabeads重悬于100μl裂解缓冲液中，加入3-5μg特异性多克隆抗体。使用IgG同种型作为阴性对照。
3. 在加入RNA酶I之前，收集10份细胞提取物（100μg）（Input）的3个等分试样注意：（i）RBP结合的定量分析（参见步骤D1a和F3），（ii）评估RBP IP（参见步骤C10a）和（iii）评估RNA酶I片段（见步骤D3和图4）。
4. 加入1 ml细胞提取物（1 mg）至100μl蛋白G Dynabeads（见步骤C2）。在冰上存放
5. 在裂解缓冲液中制备RNA酶I 1：1,000稀释液。
6. 加入每个IP 10μlRNAse I 1：1,000。
7. 在4℃下旋转2小时。
8. 孵育后将样品置于磁性支架中，从每个IP中收集上清液等分试样（100μl），并丢弃残留的上清液。在冰上储存等分试样。
  注意：评估RNA酶I片段时需要等分试样（见步骤D3和图4）。
9. 用1ml高盐缓冲液洗涤IP两次，用1ml蛋白酶K缓冲液洗涤2次。
10. 将Dynabeads重悬于100μl蛋白酶K缓冲液中。从每个IP收集10％悬浮液（10μl）的等分试样。加入10μlLaemmli缓冲液（2x）至等分试样，并在100°C下煮沸等份5-10分钟（见步骤C10a）。
  注意：通过蛋白质印迹分析评估RBP IP需要等分试样（参见C10a）。
RNA分离
1. 来自知识产权
  1. 通过向90μl剩余的IP悬浮液中加入50μg蛋白酶K（2.5μl蛋白酶K溶液）来洗脱RNA（步骤C10）。
  2. 在55℃孵育1小时。
  3. 将样品置于磁性支架中，收集上清液，加水至300μl。
  4. 在每个上清液中加入1体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
  5. 剧烈搅拌10秒。在室温下孵育10分钟。
  6. 以15,000 x g离心10分钟。收集上清液。
  7. 加入1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）
  8. 混合并加入2.5体积的绝对乙醇
  9. 在-20℃下混合并孵育过夜。
  10. 孵育后，以15,000 x g离心15分钟。
  11. 弃去上清液，用1ml 70％乙醇洗涤RNA沉淀。
  12. 以15,000 x g离心10分钟。
  13. 弃上清，空气干燥颗粒。
2. 从输入：
  1. 将50μg蛋白酶K（2.5μl蛋白酶K溶液）加入到10％输入等分试样之一（步骤C2）中。
  2. 在55°C孵育1小时。
  3. 通过向样品中加入1ml Trizol来回收RNA。在室温下孵育5分钟。
  4. 加入200μl氯仿并剧烈混合。
  5. 以12,000 x g离心15分钟。
  6. 离心后，收集一半水相（≈250μl），以避免DNA污染。
    注意：根据我们的经验，用DNA酶处理RNA输入样品不足以清除DNA污染。我们通过收集仅一半的水相并避免在用Trizol试剂进行RNA分离期间接触相间层来防止DNA污染。
  7. 加入1体积的100％异丙醇。并在室温下孵育10分钟。
  8. 以12,000 x g离心15分钟，弃去上清液。
  9. 用1ml 70％乙醇洗涤RNA沉淀。
  10. 以12,000 x g离心10分钟。
  11. 弃上清，空气干燥颗粒。
3. 控制RNA酶I片段化
  1. 将50μg蛋白酶K（2.5μl蛋白酶K溶液）加入到步骤C2和步骤C7中的一个等分试样中。
  2. 在55℃孵育1小时。加入1体积的苯酚：氯仿：异戊醇。
  3. 按照步骤D1e-D1m所述进行。
4. 将RNA重悬在20μl无核酸酶的水中。在260nm定量后，将样品加载到1.5％变性琼脂糖凝胶上以评估RNA片段化（图4）。
  
  图4.控制RNA断裂。在不同的RNA酶I稀释液（1:500对应于2U/ml的RNA酶I）存在下，并且在不同提取物浓度（0.8和2mg/ml）存在下，使具有RNA片段化的变性琼脂糖凝胶（1.5％），左右面板）。指示最佳RNA断裂（红色框）。
逆转录（cDNA合成）
1. 在相同体积的无核酸酶的水中重悬从步骤D1m和D2k的RNA颗粒。
  注意：水的体积取决于所用的cDNA合成试剂盒。
2. 在55°C下加热5分钟并储存在冰上。
3. 根据制造商的说明书使用半体积的RNA样品进行cDNA合成。使用另一半在不存在逆转录酶的情况下进行cDNA合成反应（阴性对照）。 cDNA合成必须使用随机六聚体引物进行。
  注意：需要负面控制来评估所有样品中的DNA污染。
实时定量PCR（qRT-PCR）
1. 位于前mRNA的不同区域的引物的设计对，包括嵌入RBP结合位点的区域（图5）。
  注意：
  1. 最佳PCR产物长度为100nt。
  2. 如果RBP结合位点不是已知的，可以通过使用设计为跨越整个mRNA前体的几个引物对来鉴定嵌入其中的区域。
2. 按照制造商的说明进行qRT-PCR。
  注意：阴性对照的定量循环（Cq）应该比相对样品少至少6个循环（即Cq阴性对照= 36; Cq样品= 30）。
  
  图5.用于评估RBP结合的引物前沿mRNA的位置示意图

数据分析

使用比较的ΔCq方法，RBP的结合报告为RNA靶标不同区域的输入百分比（图6）。

根据稀释度，输入Cq（Cq <5％输入<5％;参见步骤C2和D2f）需要调整为100％（Cq <100％Input ）：Cq _100％输入 = Cq <5>输入 - [log ₂（DF）]
注意：5％输入（见步骤C2和D2f）对应于20的稀释因子（DF）。此外，因此，Cq 100％输入 = Cq _5％输入 - 日志 _{子> （10）。}
将IP（Cq _IP）的Cq值与输入（Cq <100％输入）的100％的Cq值进行比较（ΔCq）：
ΔCq= Cq _IP - Cq <100％输入
注意：对于IgG IP：ΔCq IgG = Cq IgG IP - Cq _100％输入 。对于RBP IP：ΔCqRBP = Cq > 100％输入。
RBP的关联报告为％输入：％input = 100 x 2 ^-ΔCq 注意：对于IgG：％输入 _IgG = 100 x 2 ^-ΔCqIgG 。对于RBP：％输入 _RBP = 100 x 2 ^-ΔCqRBP 图6. RBP关联到RNA靶标的数据分析。 使用假设的Cq值，显示了与指定的前mRNA区域（Exon1-Intron1; Exon2-Intron2; Exon3-Intron3）结合的RBP的数据分析。 * =输入的百分比为5％，见步骤C2和D2f; DF（稀释因子）= 20; R =复制。

笔记

为了确保重复性，生物实验通常以重复（一式三份）进行。我们还建议重复执行每个CLIP IP（技术重复），以提高每个实验的可靠性（图7）。统计分析由测试程序执行。

图7.来自三个生物重复实验的RBP与RNA靶标的数据分析。使用假设值，显示了来自三个生物实验的RBP与前mRNA的结合的数据分析。通过执行每个实验的技术重复，可以消除与其他实验偏离的价值。在这个例子中，以红色突出显示的值明显偏离了其他五个。因此，可以将其从进一步分析中消除，这可能是由于错误而导致的。

食谱

注意：确保在DEPC处理过的水中准备所有以下溶液。

裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.4）
100 mM NaCl
1 M MgCl 2
0.1mM CaCl 2
1％NP-40
0.5％脱氧胆酸钠
0.1％SDS
补充新鲜的1mM DTT，0.5mM偏钒酸钠，蛋白酶抑制剂混合物，RNase抑制剂（1μl/ml）
高盐缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.4）
1 M NaCl
1 mM EDTA
1％NP-40
0.5％脱氧胆酸钠
0.1％SDS
补充新鲜的RNase抑制剂（0.5μl/ml）
蛋白酶K缓冲液
100mM Tris-HCl（pH7.4）
50 mM NaCl
10 mM EDTA
补充新鲜的RNase抑制剂（0.5μl/ml）
3 M醋酸钠（pH 5.2）
有关准备此解决方案，请参阅（Iglesias et al。，2017， http://en.bio-protocol.org/e2180 ）
Leamli缓冲区（2x）
0.125M Tris-HCl，pH6.8。
20％甘油
4％SDS
2％β-巯基乙醇
0.02％溴酚蓝
蛋白酶K溶液（20 mg/ml）
将20毫克冻干蛋白酶K溶于1毫升双蒸水中

致谢

本文提出的CLIP方法是Wang等人的修改协议（2009）。采用该方法鉴定了Calabretta等人（2016）上的PKM前mRNA上PTBP1的结合位点。我们实验室的研究得到了Telethon基金会（GGP14095）和意大利卫生部"Ricerca Finalizzata 2011"（GR-2011-02348423）和"2010年4月5日"的意大利语Ricerca sul Cancro（AIRC; IG18790）的支持，到圣诞老人卢西亚Fondazione。

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