材料和试剂

1.5ml管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
将200μLMicroAmp PCR（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：N8010840）PCR管}
清洁不锈钢刀片
One Shot ^® TOP10感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C404003）}
QIAamp ^®病毒RNA迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：52904）
随机引物（Promega，目录号：C1181）
脱氧核苷三磷酸（dNTP's，100mM），PCR等级（Roche Molecular Systems，目录号：11969064001）
AMV逆转录酶（Promega，目录号：M5101）
RNasin ^®核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2511）
外向引物：5'-ATGGCATGGGATATGAT-3'（10pmol /μl，Eurofins）
外反向引物：5'-AAGGCCGTCCTGTTGA -3'（10pmol /μl，Eurofins）
内转基因引物：5'-GCATGGGATATGATGATGAA -3'（10pmol /μl，Eurofins）
内反向引物：5'-GTCCTGTTGATGTGCCA -3'（10pmol /μl，Eurofins）
包含10x反应缓冲液（ - MgSO 4）和MgSO 4的储备溶液（25mM）的Pwo DNA聚合酶（5U /μl）（Roche Molecular Systems，目录号： 11644955001）
dH 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
Sybr安全DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：S33102）}
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
GeneRuler 100 bp Plus DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：SM0323）}
凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
CloneJet PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：K1231）}
GeneJet Plasmid Miniprep Kit（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：K0503）}
Trizma ^{®基质（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）}
乙酸冰川（BDH实验室用品，目录号：10001CU）
乙二胺四乙酸溶液0.5M（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03690）
1x TAE（见食谱）

设备

PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，型号：Applied Biosystems} 2720）
BioPhotometer（Eppendorf， http：//植物园。 harvard.edu/wp-content/uploads/Biophotometer-manual.pdf ）
水浴（JULABO，型号：SW22）
轨道摇床培养箱（Grant，型号：ES-80）
紫外透射仪（UVP，型号：TMW-20）

软件

SFFFile工具（Roche Molecular Systems）
k-mer误差校正（KEC）和经验阈值（ET）（Skums等人，2012）
MEGA 6.0（Tamura等，，2013）

程序

RNA提取和cDNA生成
1. 全身患者血清，多余至诊断检测要求，平均病毒滴度为6 HCV RNA log 10μl/ml，用作起始物质。
2. 使用QIAamp 病毒RNA迷你试剂盒，根据制造商的说明书，从140μl血清中提取RNA，将其放入1.5ml无RNase的试管中，最终体积为50μl。
3. 将11μl提取的病毒RNA与1μl（0.5μg）随机引物混合
4. 样品在75℃下孵育10分钟
5. 向其中加入含有2μl（80mM）dNTP混合物，1μl（10U）AMV逆转录酶，1μl（40U）RNasin，4μlAMV反应缓冲液的母液混合物。
6. cDNA在42℃进行60分钟，94℃3分钟
7. 样品保存在4℃，直到需要

嵌套PCR扩增HCV E1/E2基因连接

准备初级PCR主混合物，最终体积为45μl：

外转底稿：	1.5μl
外反向引物：	1.5μl
10x反应缓冲液（ - MgSO 4） 4 ）：	5μl
dNTP组合：	1μl
硫酸盐 4 库存解决方案：	3μl
Pwo：	0.5μl
PCR级水：	32.5微升

然后将5μlcDNA加入到主混合物中。
1°PCR循环参数：
1. 初始变性：94℃3分钟
2. 周期条件（重复35个周期）：
  变性：在94℃下15秒
  退火：51°C 30秒
  延长：72°C 30秒
3. 最终延伸：72°C 7分钟
将样品保持在4°C直至需要。

准备二级PCR的主混合物，最终体积为46μl：

内向前引物：	1.5μl
内反向引物：	1.5μl
10x反应缓冲液（ - MgSO 4） 4 ）：	5μl
dNTP组合：	1μl
硫酸盐 4 库存解决方案：	2μl
Pwo：	0.5μl
PCR级水：	34.5微升

然后将4μl初级PCR样品加入到主混合物中。
2°PCR循环参数：
1. 初始变性：94℃3分钟
2. 周期条件（重复35个周期）：
  变性：在94℃下15秒
  退火：53°C 30秒
  延长：72°C 30秒
3. 最终延伸：72°C 7分钟
样品保存在4℃，直到需要
为了确保模板的初始量不受限制，制备1：100稀释的病毒RNA，当用作所述的巢式PCR的起始模板时，应产生通过凝胶电泳显示每个样品的扩增子。 br />

制备焦磷酸测序样品
1. 倒入2个2％的TAE琼脂糖凝胶，一个含有Sybr安全DNA凝胶染色剂，一个不含
2. 一旦凝固，凝胶分成两部分，其中一半的凝胶含凝胶染色剂与第二个凝胶结合而没有凝胶染色。
3. 将50μl扩增子样品分成两个（10μl和40μl），并在上述凝胶上分离。使用Sybr safe将10μl样品染色，而40μl样品未染色并向下进行下游。在这种情况下，所得的扩增子为320bp（图1）
4. 使用干净的不锈钢刀片将含有未染色带（40μl样品）的凝胶区域切割，使用染色的10μl样品作为定位引导物，并转移到干净的1.5ml管中。
5. 使用凝胶提取试剂盒根据制造商的说明书将扩增子凝胶提取。
6. 使用BioPhotometer量化提取的扩增子。
7. 以等摩尔浓度制备样品，稀释至终浓度为1×10 7分子/ml。
8. 焦磷酸测序外包给Roche 454生命科学（Brandford，CT，USA）。
  
  图1扩增子可视化在琼脂糖凝胶电泳之后证实了320bp扩增子的成功扩增。加载10μl2°PCR样品。
克隆分析
1. 使用CloneJet PCR克隆试剂盒克隆纯化的扩增子，并使用制造商的说明书，使用3：1插入物与载体的摩尔比转化成One Shot TOP10感受态细胞。
2. 生成每个样品20个克隆
3. 按照制造商的说明书，使用GeneJet Plamsid Miniprep Kit纯化质粒。
4. Eurofins进行E1/E2插入片段测序。
5. 检查所有痕迹文件以排除存在双峰或不明确序列区域的序列。
数据处理和纠错
1. 原始sff数据文件使用SFFFile工具进行管理。
2. 低于预期扩增子长度的90％的低质量读取和读取被移除。
3. 使用具有γ分布和不变位点（GTR + G + I）的一般时间 - 可逆模型（使用MEGA 6.0）（Tamura等，2013）克隆数据的系统发生分离。
4. 具有引导值（1,000次重采样）的主分支> 85个被分类为（次）谱系（Palmer等人，2014年）。
5. 随后将两个24-bp基序定义为每个（亚）谱系的HVR1氨基酸谱，并将其应用于序列分析管线。该基序的第一个15-bp跨越E1的保守的3'末端。剩余的9-bp包括在E2的5'末端HVR1的前3个氨基酸。
6. 使用的图案的总数反映了主要HVR1随时间的观察到的变化。对于每个（亚）谱系，两个基序参考序列被认为是足够的
7. 为了提高测序误差校正算法（KEC-ET）的灵敏度，根据相应图案的存在对UDPS数据进行分区。
8. 为了确保分析数据的质量和不存在PCR和测序嵌合体，与该图案集中的最佳匹配序列具有超过3bp差异的读数被去除。
9. KEC由三个阶段组成
10. 使用KEC的以下参数：k = 25和i = 3

数据分析

在原始文章 http://jvi.asm.org/content/88/23/13709.short （Palmer等人，2014）。

笔记

将所有血清样品进行基因分型，并通过Molecular Virology Diagnostic&科克大学医院研究实验室，科克，爱尔兰。 https://www.ucc.ie/EN/meddept /人/利亚姆 - 范宁/mvdrl/

食谱

1x TAE
4.84克三碱基
1.15ml乙酸冰川
2 ml 0.5 M EDTA 将dH ₂ O添加到1 L

参考

Palmer，BA，Dimitrova，Z.，Skums，P.，Crosbie，O.，Kenny-Walsh，E.and Fanning，LJ（2014）。通过超临界焦磷酸测序法绘制的慢性丙型肝炎病毒复合体内病毒群体的进化和结构分析。 J Virol 88（23）：13709-13721。
Skums，P.，Dimitrova，Z.，Campo，DS，Vaughan，G.，Rossi，L.，Forbi，JC，Yokosawa，J.，Zelikovsky，A.and Khudyakov，Y。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22759430"target ="_ blank">对病毒扩增子的下一代测序进行有效的纠错。 BMC生物信息学 13 Suppl 10：S6。
Tamura，K.，Stecher，G.，Peterson，D.，Filipski，A.and Kumar，S。（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/24132122"target ="_ blank"> MEGA6：分子进化遗传分析版本6.0。Mol Biol Evol 30（12）：2725-2729。 />