材料和试剂

Falcon管（15ml）（Corning，Falcon ^{®，目录号：352196）}
Eppendorf管
盖玻璃，1.5,22毫米<2>（康宁，目录号：2850-22）
培养皿（100 x 15毫米）（康宁，目录号：351029）
Kimwipe
微型幻灯片（康宁，目录号：2948-75X25）
无菌过滤器：0.22μm醋酸纤维素过滤瓶（Corning，目录号：430769）
猕猴桃果蝇游荡三龄幼虫（Ashburner，1989）
电子。大肠杆菌（DH5α）组成型表达GFP
1. peGFP（ https://www.addgene.org/vector-database / 2485 / ）
2. pET-GFP-C11（）
冰桶
LB生长培养基（Fisher Scientific，目录号：BP1425-500）
具有10％FBS（Atlanta Biologicals，Advantage，目录号：S11095）的施耐德果蝇培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21720）}
S2细胞培养基
PBSS = 0.3％皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：S7900）在PBS中
10％NGS
Phalloidin Alexa 594（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A12381）}
Vectashield（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
透明指甲油
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285）
盐酸（HCl）
氢氧化钠（NaOH）
多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：19208）
在PBSS中的10％正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
10x PBS（参见食谱）
8％多聚甲醛（见配方）
固定剂：PBS中4％多聚甲醛（见配方）

设备

分光光度计（Molecular Devices，型号：SpectraMax M2）
用于15 ml Falcon管的低速离心机（Eppendorf型号：5804 R）
用Leica L2冷光源解析立体显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica L2）
精细解剖钳（精细科学工具）
37°C振荡孵化器（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Innova ^{® 44）}}
25℃培养箱（BioCold Environment，型号：BC49-IN）
解剖盘
共焦显微镜
注意：我们使用具有63 x NA1.4目标的Zeiss LSM510（Zeiss，型号：LSM510）。

软件

ImageJ（NIH）
棱镜（GraphPad）

程序

GFP表达的制备E。大肠杆菌
1. 用绿色大肠杆菌菌落接种50ml LB肉汤。
2. 在37℃下振荡孵育过夜。
3. 使用分光光度计测量600nm处的光密度（OD 600）。
  1. 用肉汤和肉汤测量细菌。
  2. 用肉汤从细菌中减去新鲜LB肉汤的OD 600
4. 将细菌稀释至OD 600 <0.1
  1. 在室温下，在15ml Falcon管中将10ml细菌溶液以4,000×g旋转10分钟。
  2. 滗水LB肉汤
  3. 通过在足够的1x PBS中涡旋重新悬浮，将细菌调节至0.1的OD 600。
  4. 将1ml等份装入Eppendorf管中
  5. 将管放置在65°C 20分钟即可杀死。
  6. 准备使用时冻结等分并解冻。
5. 用FBS将细菌重新悬挂在施奈德的果蝇培养基中
  1. 将离心的Eppendorf管以4,000 x g的热灭活GFP细菌在室温下离心10分钟。
  2. 滗析PBS上清液
  3. 加入1毫升施奈德的果蝇培养基，涡旋重新悬挂。
  4. 对于大肠杆菌，我们使用这种方法每μl溶液产生约40,000个细菌。
  5. 一旦重新悬浮，在暴露于细胞前温热至25°C
原发性血细胞分离
1. 温暖的新施耐德果汁中等至25°C。
2. 收集十只流浪的三龄幼虫在一大滴水中彻底解剖清洗，放入新鲜的水滴。
3. 将一个22毫米^{2 盖玻片放在100 x 15毫米的培养皿中。}
4. 从步骤B1向盖玻片添加200μl施耐德果蝇培养基。
  1. 这应该会产生一个大的液滴
  2. 保持液滴的面积尽量小。
  3. 不要让液滴散布在盖玻片上。
5. 将洗涤的幼虫置于盖玻片上的大液滴中。
6. 在解剖显微镜下，使用镊子夹住并固定幼虫的尾端，并使用另一镊子从尾部到嘴部抓住并撕开幼体的外角质层（见图1）。
  
  图1.幼虫解剖。该图像描绘了钳子用于保持（左镊子）的方式，并用右侧钳子沿着幼体中线（锯齿状黑线）剖开用S2细胞培养基覆盖的幼体的角质层，从而将幼虫血淋巴释放到S2细胞培养基
7. Rip打开盖玻片上的媒体液滴中的所有十个幼虫。
  注意：尽快执行此步骤。
8. 从媒体液滴中清除幼体尸体。
9. 在培养皿中的盖玻片上的培养基中孵育血淋巴以允许血细胞附着于盖玻片（在25℃下15分钟）。
  1. 这种15分钟的孵化将足以使血细胞粘附到盖玻片上。
  2. 大约10分钟后，可能开始发生黑化现象（见图2）
  3. 如果媒体具有小的黑点，则开始使用PBS洗涤。这些表明我们试图避免的黑化开始。
  4. 不要让媒体变黑。
    
    图2.黑化的早期迹象。图像显示一个盖玻片（22 x 22毫米），一滴含有沉积在盖玻片上的血细胞的培养基。随着时间的推移，介质中的晶体细胞将引发黑色化，可以通过溶液中的黑点（箭头）和滴液边缘的黑色环（箭头）检测。在这个阶段，血细胞应该用PBS洗涤去除晶体细胞
10. 将1x PBS小心地倒入盖玻片中的培养皿中，以避免剥离贴壁细胞。
  1. 慢慢地旋转盘子彻底清洗。
  2. 从培养皿中倒出PBS。
  3. 重复洗涤（B10）。
11. 血细胞将粘附在盖玻片上，而PBS洗涤除去大多数主要负责黑化的晶体细胞。
12. 用镊子取下盖玻片并放在Kimwipe上，然后放在冰上的干燥培养皿中。
将血细胞暴露于GFP细菌
1. 在步骤A5（40,000细菌/μl）的施奈德果蝇培养基中添加足够的GFP细菌以覆盖整个盖玻片而不溢出盖玻片的边缘（〜200μl）。
2. 将细菌与血细胞在冰上孵育20分钟，以使细菌粘附到细胞表面
3. 将PBS倒入培养皿中冲洗3次，轻轻旋转。倾倒掉PBS。
4. 用镊子取下盖玻片，放在Kimwipe上，然后放在干燥的培养皿中。
5. 在盖玻片上添加新鲜温暖的施奈德果蝇培养基，达到所需的追逐时间（在野生型血细胞中，大部分细菌将被消化，45分钟不能检测到）。
修复，染色和挂载血细胞（均在室温下进行）
1. 用PBS清洗培养基。
2. 添加足够的4％多聚甲醛以覆盖盖玻片而不会溢出其边缘。
3. 修复细胞30分钟。
4. 用PBS彻底清洗细胞。
5. 加入PBSS 30分钟以使细胞膜透化
6. 去除PBSS并加入10％NGS在PBSS中30分钟以阻止非特异性抗体结合
7. 用您选择的一级和二级抗体和/或Phalloidin-Alexa 594在PBSS中染色一小时。
  注意：在二次抗体染色期间和之后，尽可能多地将标本保持在黑暗中。
8. 每次抗体后3×15分钟用PBS洗涤。
9. 将盖玻片放在kimwipe上干燥。
10. 在显微镜载玻片上添加一小滴Vectashield。
11. 慢慢地将带有染色血细胞的盖玻片放在Vectashield的下落上
12. 用指甲油将盖玻片的边缘密封到滑块上。
13. 在共焦显微镜上用63x物镜和3倍数码变焦对图像进行成像。

数据分析

为了确定不同遗传背景下不同时间点的剩余细菌数，用ImageJ（NIH）打开共焦图像，并在合并细菌和鬼笔环素染色通道之前用高斯模糊平滑。计数单个细胞内的细菌数，并将其记录在Prism（GraphPad）电子表格中作为每个细胞的单一数据点。当整个GFP细菌被鬼笔环肽染色包围时，计数细菌。对于三个实验中的每一个计数至少25个细胞。 Prism软件用于绘制盒子和晶须图，并执行单因素方差分析比较相关数据集（全部）。

笔记

上述实验对我们实验室对原代血细胞内细菌积累和吞噬体成熟的分析（图3）和不同基因型的影响（Akbar等人，2011; Rahman et al。等等，2012年; Akbar等人，2016）。追踪时间和抗体条件可适用于各种实验问题。然而，在从幼体中分离血细胞的初始步骤中必须非常小心。如上所述，施耐德果蝇中等细胞培养基液滴必须保持穹顶状，以便容纳液滴内的幼虫，并将血细胞保持在具有丰富营养物质的限定区域内。

图3.吞噬不同阶段的血细胞和GFP表达细胞的显微照片。通过染色Hook（红，Krämer和Phistry，1996）和Spinster（蓝色， Sweeney和Davis，2002）
通过我们的手术分离的血细胞主要是吞噬活性血浆细胞，但也含有构成血细胞池约5％的晶体细胞（Tepass等人，1994）。激活后，晶体细胞分泌由蛋白水解激活的酚氧化酶。随后，活化的酚氧化酶引发干扰细菌降解产物成像的黑化反应（Neyen等人，2014）。因此，在所有的幼虫被撕开并随后从培养基中除去之后，至关重要的是防止施耐德的果蝇介质变黑。黑化过程将在幼虫解剖开始后约10分钟开始，并且将进行血细胞吞噬其他血淋巴细胞（即，晶体细胞）。其他研究人员（Tirouvanziam等人，2004）将蛋白酶抑制剂加入到分离培养基中以抑制引发黑化的蛋白酶级联。然而，我们发现我们的方法足以减少黑化，同时避免蛋白酶抑制剂对吞噬体成熟和细菌降解的任何潜在影响。

食谱

10倍PBS储备溶液
80克NaCl
2克KCl
26.8g Na 2 HPO 4＆lt; 7H 2＆lt; 2＆gt;＆lt; /＆gt; 2.4g KH 2 PO 4
溶于800毫升ddH 2 O - / - 用HCl调节pH至7.4
将ddH _{2 O添加到1L，并且很好地混合}
8％多聚甲醛溶液
1. 加热200毫升dH 2 O至55℃（但不加热！）
2. 加入2滴50％w / w NaOH
3. 加入20g多聚甲醛
4. 持续搅拌直到清除
5. 真空过滤器通过0.22μm过滤器
6. 加入ddH _{2 O以将最终体积调整至250ml}
7. 将等份2毫升装入15毫升Falcon管中
8. 存放于-80°C
固定剂：PBS中4％多聚甲醛
1. 解冻2毫升等份8％多聚甲醛
2. 加入1.6ml dH 2 O O
3. 加入400μl10倍PBS储备溶液
4. 混合好

致谢

本文的工作由NIH Grants EY010199，EY021922支持。该协议已经从我们之前发表的作品（Akbar等人，2011; Akbar等人，2016）进行了修改和修改。这项工作的作者声明没有利益冲突。

参考

Ashburner，M.（1989）。果蝇：实验室手册冷泉港实验室出版社。

Akar，MA，Mandraju，R.，Tracy，C.，Hu，W.，Pasare，C.和Kramer，H。（2016）。 ARC综合征相关的Vps33B蛋白是炎症性内体成熟和信号终止所必需的。免疫性 45（ 2）：267-279。

Akbar，MA，Tracy，C.，Kahr，WH和Kramer，H.（2011）。＆nbsp; 在果蝇免疫防御期间，全细菌基因是吞噬细胞成熟所必需的。 J Cell Biol 192 3）：383-390。

Kleino，A.和Silverman，N。（2014）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23721820”target =“_ blank” >果蝇 IMD途径在体液免疫反应的激活中。 Dev Comp Immunol 42（1）：25-35。

Kocks，C.，Cho，JH，Nehme，N.，Ulvila，J.，Pearson，AM，Meister，M.，Strom，C.，Conto，SL，Hetru，C.，Stuart，LM，Stehle，，Hoffmann，JA，Reichhart，JM，Ferrandon，D.，Ramet，M.and Ezekowitz，RA（2005）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm。 nih.gov/pubmed/16239149“target =”_ blank“>食者，介导果蝇中细菌病原体吞噬作用的跨膜蛋白。 123（2）：335-346。

Krämer，H.和Phistry，M.（1996）。果蝇钩子基因中的突变抑制了上皮跨膜配体进入多泡体的内吞作用。 J Cell Biol 133（6）：1205-1215。 br />

Lemaitre，B.和Hoffmann，J.（2007）。果蝇黑腹果蝇的宿主防御 Annu Rev Immunol 25：697-743。

Neyen，C.，Bretscher，AJ，Binggeli，O. and Lemaitre，B。（2014）。＆nbsp; 研究免疫力的方法方法 68（1）：116-128。

Parsons，B.和Foley，E.（2016）。＆nbsp; 果蝇 melanogaster的细胞免疫防御 Dev Comp Immunol 58：95-101。

Rahman，M.，Haberman，A.，Tracy，C.，Ray，S。和Kramer，H。（2012）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/22934826“target =”_ blank“> 果蝇淡紫色突变体揭示了吞噬体和自噬体成熟后期的LYST同源物的作用。 / em> 13（12）：1680-1692。

Sweeney，S.T.和Davis，G.W。（2002）。无限制的突触后增长在一个晚期涉及TGF-β介导的突触生长调节的内体蛋白。神经元 36（3）：403-416。

Tepass，U.，Fessler，LI，Aziz，A.and Hartenstein，V.（1994）。血液细胞的胚胎起源及其与果蝇中细胞死亡的关系发展 120（7）：1829-1837 。

Tirouvanziam，R.，Davidson，CJ，Lipsick，JS和Herzenberg，LA（2004）。果蝇血细胞的荧光激活细胞分选（FACS）显示与哺乳动物白细胞重要的功能相似性。 Proc Natl Acad Sci USA 101（9）：2912-2917。