材料和试剂

手套
实验室外套
培养管（16×100mm）（VWR，目录号：47729-576）
4毫升玻璃小瓶和盖子（13-425螺纹牙膏，硼硅酸盐玻璃）（VWR，目录号：46610-706）
HPLC自动进样器小瓶和盖子（9-425线程）（VWR，目录号：89523-482）
移液器吸头（标准1000μl和200μl）
凝胶装载移液器吸头（VWR，目录号：37001-150）
将圆底烧瓶连接到Allihn冷凝器的接头夹（VWR，目录号：89426-304）
制造商：GLASSCOLABS，目录号：007.470.05A。
Eppendorf管（标准1.5 ml）
乙酸铵（对于LC-MS LiChropur ）（EMD Millipore，目录号：533004）
水（HPLC级）（VWR，BDH ，目录号：BDH23595.400）
氢氧化铵（H 2 O 2中为28％NH 3，≥99.99％）（Sigma-Aldrich，目录号：338818）
（98％）（剑桥同位素实验室，目录号：DLM） -1000-1）
L-胱氨酸（≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：C8755）
DL-胱氨酸二甲酯二盐酸盐（≥95％）（Sigma-Aldrich，目录号：857327）
乙腈（HPLC级）（VWR，BDH ，目录号：BDH83639.400）
乙酸铵溶液（见食谱）

注意：为所列材料和试剂提供了具体的品牌和目录号（我们的工作中使用的）。但是，我们并没有明确认可任何这些品牌或产品，大多数商品可以从其他知名厂商获得。此外，大多数这些产品/目录号是基于美国目前的可用性，因此其他国家的研究人员可能会发现有必要从另一个供应商处获取材料。

设备

pH计（标准）
安全护目镜
化学安全罩
玻璃瓶（标准500毫升和1升）
玻璃量筒（标准1升，250毫升和100毫升）
玻璃圆底烧瓶（标准24/40地面接头，100ml）
磁力搅拌棒（标准）
回流装置（标准，由搅拌加热罩组成，具有水套和24/40接头的Allihn冷凝器，自来水源，橡胶管和用于附接的夹子）。遵循供应商的汇编说明
移液器（标准1000μl和200μl）
涡旋（标准）
-20°C冰箱（标准）
4℃培养箱或冰箱（标准）
HPLC-MS系统：

HPLC：具有以下模块的Shimadzu UFLC突出体系（HPLC）（Shimadzu，型号：Prominence UFLC）：CBM-20A（通信总线模块），DGU-A 3（脱气器），两个LC-20AD （液相色谱仪，二元泵），SIL-20AC HT（自动进样器）
HPLC柱：Luna NH 2柱（2×50mm，3μm，100）（Phenomenex，目录号：00B-4377-B0）
质谱仪：配有Turbo V™超声波离子源的AB Sciex 4000 LC-MS / MS质谱仪（AB Sciex，型号：QTRAP），/ / sup> 4000

离心机（标准品，附有4ml小瓶）
称重秤（标准）

注意：标准实验室设备应用于此测定，如图所示。已经为HPLC-MS设置的组件提供了特定的品牌和目录号（如我们的工作中所使用的），这些可以由其他供应商的设备替代;可以说任何HPLC-MS设置都可以用于该测定，但是可能需要根据供应商提供的说明进行额外的优化。

软件

AB Sciex的分析师^® v1.6.1，用于数据采集，LC方法的开发和分析物特异性MRM（多反应监测）转换的优化
对于LC-MS / MS数据分析，AB Sciex的Peakview ^® v2.1和Skyline ^® v3.6 ²³

程序

解决方案的准备和药物标准
1. 在HPLC级水中准备2升20mM乙酸铵。这将用于HPLC样品制备，以及制备其中一个HPLC流动相。
  注意：2 L是建议体积，根据预期的待测药物数量进行调整。
2. 通过以约0.5ml的批次加入氢氧化铵然后pH测量将该溶液的pH调节至约9.0-9.5（这不一定是准确或可重复的）。标准pH计可用于此目的;但是，建议将pH探针直接浸入溶液中。相反，将小的等分试样（〜0.5-1ml）转移到培养管中进行每一周的pH测量。
  注意：氢氧化铵腐蚀性很强;在处理该化合物时，应始终佩戴手套，安全护目镜和实验衣。也可以在化学品安全罩内部处理。
3. 在干净的玻璃瓶（1升）中将950毫升pH调节的20mM乙酸铵溶液测量，并加入50ml乙腈（ACN），使用合适的玻璃瓶。这将用作HPLC的流动相A.
  注意：该溶液可以在室温下储存约2周。瓶子和玻璃瓶应先用HPLC水彻底清洗，然后用ACN彻底清洗（使用清洁剂/肥皂）。
4. 测量1 L的ACN到另一个干净的玻璃瓶（1升）。这将用作HPLC的流动相B。
  注意：ACN可以在室温黑暗中储存，使用时间长达6个月。
5. 将400ml pH调节的20mM乙酸铵溶液（来自步骤A2）置于500ml玻璃瓶中。重量约29.2mg的3,3,3'，3' - -L-胱氨酸（称为 d _{4 -CC），并充分混合并溶解并生成300μM _{EM> 4 -CC。
  注意：该解决方案可以在-20°C下等分并储存几个月。}}
6. 从这个300μM的解决方案中准备足够量的30μM通过用pH调节的20mM乙酸铵溶液（来自步骤A2）稀释（10倍）来进行。
  注意：此解决方案应为每批准备新鲜。 3.6ml该溶液将作为测定中使用的每个小瓶的内标使用，根据被测试的药物（和复制）的数量计算所需的量。
7. 在HPLC级水（5x）中准备500μl各2.5mM和250μMDL-胱氨酸二甲酯（CDME）溶液。使用CDME作为测定的阳性对照，因为已显示其显着增加胱氨酸的溶解度（Rimer等人，2010; Zee等人，2017）。
8. 准备试验药物溶液（5x）：称量测试药物并溶解在HPLC级水中以达到比预期要高5倍的浓度;在测定过程中，将其稀释至1倍。
  注意：药物可能会造成健康和/或环境危害;因此，应以妥善的安全预防措施处理。
9. 准备阳性对照小瓶（每个4个重复）：两套4 x 4毫升玻璃小瓶，每个100微升2.5微克和250微克CDME溶液（来自步骤A7）。在测定过程中，这将被稀释5倍，以达到最终浓度分别为500μM和50μMCDME。
10. 准备阴性对照小瓶（每个4个重复）：一套4×4ml玻璃小瓶，每个HPLC水100μl。
11. 准备药瓶（每个4个重复）：一套4×4ml玻璃小瓶，每个5μl药物溶液100μl（来自步骤A8）。在测定过程中，将其稀释至1倍。
  
  注意：
制备胱氨酸过饱和溶液
1. 在圆底烧瓶中加入〜96mg的L-胱氨酸（称为CC），并加入100ml的HPLC级水，以达到终浓度为4mM的CC。
  注意：
  1. 再次用HPLC级水，ACN和水彻底清洗圆底烧瓶。避免使用肥皂/洗涤剂。
  2. CC在这个阶段不会解散。
  3. 100毫升是一个建议的体积，根据预期的药物数量进行调整。这是一个典型的情况，当10种药物被测试在两个浓度（每个条件4个复制）：在这种情况下，将有80个药物小瓶（10药物x 2浓度x 4重复每个）和额外的12个小瓶为阳性和每个设置中使用的阴性对照（参见步骤A9和A10），即总共92×4ml小瓶。对于这样的设置，需要总共92×400μl，即36.8ml的4mM CC溶液（参见下文，步骤C1）。因此，制备50ml回流溶液（通过称重〜48mg CC）就足够了。
2. 加入一个磁力搅拌棒（适合尺寸）。
3. 将装有搅拌棒和CC悬浮液的圆底烧瓶装入回流装置。使用夹子将烧瓶牢固地连接到Allihn冷凝器，并打开通过冷凝器护套的水流。确保通过冷凝器达到稳定（但不是活力）的水流。
  注意：回流是指将溶剂（或悬浮液）加热至沸点并允许蒸发的溶剂冷凝回原始烧瓶的过程，最常用冷却水流过Allihn冷凝器。回流确保溶剂（或悬浮液）始终保持在其沸点（固定温度），长时间，而不会由于蒸发造成任何显着的溶剂损失。
  注意：回流装置应安装在化学品安全罩内。该过程需要在高温下加热，因此应采取适当的安全预防措施。
4. 当通过回流冷凝器的水流稳定时，开启搅拌和加热。优选以中等速度（基于各个搅拌器设置）并在略高于水沸点（〜105-110℃）的温度下加热。仔细观察烧瓶（每2-3分钟一次），使冷凝器底部形成水滴;当第一（近似）冷凝水滴落回烧瓶中时，将时间标记为开始回流。
5. 将CC悬浮液回流约20分钟，或直到所有CC溶解以产生4mM过饱和CC溶液。
6. 关闭搅拌和加热。
7. 从圆底烧瓶中取出加热套。
  注意：强烈建议地幔和烧瓶都非常热，使用防护手套和实验室外套。
8. 放置30-40分钟，或直到过饱和CC溶液冷却至几乎室温，而不影响溶液。
  注意：在整个过程中仍然需要恒定的水流过回流冷凝器。
胱氨酸沉淀试验
1. 当将来自步骤B8的过饱和CC溶液冷却至几乎室温时，小心地将Allihn冷凝器从烧瓶中分离出来。使用移液管将400μl该溶液转移到对照（阳性和阴性）以及步骤A9-A11中制备的药物瓶中。
  注意：此步骤应在B8之后立即完成。此外，请确保不要不必要地干扰过饱和CC解决方案，即不仅需要传输，否则CC可能会崩溃。
2. 简单地旋转每个小瓶以使内容物均质化。
3. 在4℃的孵育箱或冰箱中孵育小瓶48-72小时（理想情况下保持一致的温度，没有太大的波动）。
4. 在孵育期结束时，在4℃下以1,300×g离心小瓶15分钟。
5. 用1 ml移液管小心地清除每个小瓶中的上清液，而不会影响结晶CC沉淀。接下来，使用凝胶加载尖端和合适的移液管，除去剩余的上清液，而不会吸收任何沉淀的胱氨酸颗粒。丢弃上清液。
  注意：该步骤需要一些实践来有效地去除所有上清液，同时保留大部分CC颗粒;我们建议在运行药物实验之前，先进行一些正面和负面对照的练习。
  注意：上清液中可能含有危险药物/化学物质;因此上清液的处理应按照各自的研究方针进行。
6. 使用1ml移液管向每个小瓶（4×900）加入3.6ml30μM的细胞-CC溶液（在A6中制备） μl转移到每个小瓶）
7. 涡旋很好地结合内容。沉淀的CC可能在此阶段完全溶解。
8. -20℃冷冻溶液。
  注意：
沉淀胱氨酸的基于质谱的定量
1. 当准备好分析时，在室温下解冻沉淀小瓶的内容物（步骤C8）。
2. 一旦在室温下，短暂旋转小瓶，仔细检查每个小瓶以保留CC沉淀物。在这一点上，所有的小瓶都应该有明确的解决方案。
  注意：按照指示的步骤，我们在这个阶段从未经历过残留的沉淀。尽管如此，某些药物可能会降低CC溶解度，使得大量的CC在孵育期间沉淀，而不是全部回到溶液中。在这种情况下，有必要将小瓶内容物（包括任何剩余的沉淀物）转移到较大的管中，加入更多的HPLC级水（4/6/6） -CC将在质谱定量过程中对任何稀释效应进行归一化），并为这些小瓶重做步骤C8和D1。
3. 将1毫升透明溶液从每4毫升小瓶转移到预标记的HPLC自动进样器小瓶中。
4. 用1ml HPLC级水准备一个空白的小瓶，以及一个内径标准的小瓶，其中有1 ml的30μM CC溶液（在A6中制备）。
5. 按照供应商特定的说明，使用HPLC-MS / MS分析样品。简而言之，这包括以下步骤：

数据分析

通过计算CC的量词峰值曲线下面积（AUC）来量化每个小瓶中CC沉淀物的量。图1示出了示例性AUC，其用作样品中CC量的替代物。另见注3

图1.表示胱氨酸（CC）的MRM转变的提取离子色谱图（XIC）（ m / z 241.1→152.0）。红色阴影区域显示该样品中CC的曲线下面积（AUC），与样品中CC的数量成正比。
使用曲线下的对应区域归一化AUC，以获得nAUC值，以获得nAUC值。这些nAUC值可以用作每个小瓶中CC沉淀量的替代物。
使用标准统计分析方法，例如Student's试验（参见图2），比较归一化的阴性对照nAUC值与药物或CDME nAUC值（在步骤E2中获得）的值。 CDME用作阳性对照。在我们的经验中，500μMCDME几乎没有CC沉淀和非常低的nAUC，而50μMCDME导致中等量的沉淀，导致与空白相比nAUC的适度降低（图2）。
与空白相比，导致nAUC值显着降低的任何药物都应考虑进一步研究，例如在胱氨酸尿的小鼠模型中测试（Zee等人，2017）。

图2.在水（空白）和L-胱氨酸二甲酯（CDME，50和500μM）存在下结晶后获得的L-胱氨酸沉淀的相对产率，阳性对照。错误栏是SD。

笔记

我们通常认为这种测定是可重复的，只要培养温度（步骤3C）在多个实验之间是相当一致的。
尽可能高度推荐使用HPLC级水。
D4-CC（3,3,3'，3' - 4 -L-胱氨酸），市售的胱氨酸同位素（ CC）已经用于协议以帮助CC估计。与大多数同位素相似，CC和D4-CC在化学上几乎相同;因此，它们具有相似的化学和物理性质（如溶解度）。然而，在质谱实验中，它们容易区分，因为在m / z 241处的CC电离和在m / z 245处的D4-CC。在该实验中，每个小瓶中加入特定量的D4-CC，监测样品中的CC和D4-CC有助于了解实际化合物（CC）是否可能经历D4中变化所指示的任何意外修改或稀释-CC水平。

食谱

乙酸铵溶液

称量〜3.1g乙酸铵在玻璃瓶中
加入2升HPLC水（小批量溶解）
使用氢氧化铵将pH调节至9-9.5

致谢

这项工作得到了美国老龄化研究联合会（PK），Larry L. Hillblom基金会（PK），波士顿科学基金会（MS）和NIH（R01 AG038688＆amp; R01 AG045835至PK; R21 DK091727）的资助。至PK和MS; P20 DK100863＆amp; R21 DE025961至MS）。感谢见杨和大卫·霍尔为检测设置提供帮助。这里提出的胱氨酸溶解度测定作为我们最近出版的关于α-硫辛酸作为在胱氨酸尿症小鼠模型中预防胱氨酸肾结石的药物的鉴定的一部分而开发的（Zee等人， 2017年）。我们承认Rimer，J.D。等人的工作。确定CDME以显着增加胱氨酸溶解度并发表了早期版本的测定法的Science（Rimer et al。，2010）中的。

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