材料和试剂

RQ1 DNA酶（Promega Corporation，目录号：M6101）
小牛肠磷酸酶（F.Hoffmann-La Roche，目录号：713023）
苯酚/Chlorophorm（1：1）（MP Biomedicals，目录号：AQUAPH01）/
（Carlo Erba，目录号：438601）
T7RNA聚合酶（Promega Corporation，目录号：P207B）
T4多核苷酸激酶（Biolabs，目录号：M0201）
RNasin RNA酶抑制剂（Promega Corporation，目录号：N2611）
DTT（Promega Corporation，目录号：P117B）
NTPs（F.Hoffmann-La Roche，目录号：set1277057）
γ^{32 P GTP（6,000Ci/mmole，10μC/μl）（PerkinElmer，目录号：BLU504Z）}
γ^{32 P ATP（3,000Ci/mmole，10μCi/μl）（PerkinElmer，目录号：BLU502A）}
3 M NaOAc（pH 4.7）（见配方）

设备

Illustra ^TM MicroSpin ^{TM G-25柱（GE Healthcare，型号：27-5325-01）}

程序

5'-P RNA的合成
1. 体外转录（30μl）
  T7 RNA聚合酶5x缓冲液 6微升
  RNasin（40U /μl）    0.75μl
  100 mM DTT    3微升
  2.5 mM NTPs       6微升
  DNA模板（PCR片段） 400 ng
  H 2 O（不含核糖核酸酶）   到最终体积（30μl）
  T7 RNA聚合酶（20U /μl）    1.5μl
  1. 在37℃下孵育1小时30分钟。
  2. 加入反应混合物2μlRQ1 DNA酶（1 U /μl）。
  3. 在37℃孵育30分钟（模板DNA的消化）。
  4. 放在冰上停止反应。
  5. 加入18μlH 2 O以使体积为50μl。
  6. 通过Spin-G25柱（在凝胶床上装载样品，在735×g离心2分钟（在微量离心机中〜3,000rpm））纯化RNA。
2. 脱磷化步骤（50μl）
  小牛肠磷酸酶（CIP 1U /μl） 2.5μl
  CIP 10x缓冲区      5微升
  纯化RNA    32.5微升
  H ₂ O       10μl
  1. 在37℃孵育30分钟。
  2. 加入1体积苯酚/Chlorophorm（1:1），涡旋3分钟。
  3. 在> 10,000×g离心3分钟以分离各相。
  4. 沉淀上层水相，加入1/10体积。 3 M NaOAc（pH 4.7）+ 3vol。 ETOH（96％）。
  5. 在> 10,000×g离心10分钟，取出EtOH，并通过倒置管用70％EtOH洗涤沉淀一次。
  6. 风干沉淀并吸收所需体积的H 2 O中的RNA。
3. 标记反应（20μl）
  脱磷酸化RNA    1微克
  T4多核苷酸激酶10x缓冲液 2微升
  RNase抑制剂（40 U /μl） 0.25μl
  γsup 32 P ATP（10μCi/μl）<        5微升
  T4多核苷酸激酶（10 U /μl） 1.25μl
  H ₂ O      至20μl终体积
  1. 在37°C孵育2小时。
  2. 如步骤2中沉淀，并以所需体积吸收沉淀。
5'-PPP RNA的合成 T7 RNA聚合酶5x缓冲液 6微升
RNasin（40U /μl）    0.75μl
DTT（100mM）     3微升
ATP，UTP，CTP（2.5mM）     6微升
GTP（100μM）    3.75微升
PCR     400 ng
γ³² P GTP     7.5μl
H ₂ O    到30μl最终量
T7 RNA聚合酶（20U /μl） 1.6μl
1. 在37℃孵育1小时，30分钟。
2. 加入反应混合物2μlRQ1 DNA酶（1 U /μl）。
3. 在37℃孵育30分钟（DNA的消化）。
4. 用1/10体积的3M NaOAc（pH 4.7）+ 3vol EtOH +25μg糖原沉淀。
5. 在> 10,000×g离心10分钟，取出EtOH，并通过倒置管用70％EtOH洗涤沉淀一次。
6. 风干沉淀并吸收所需体积的H 2 O中的RNA。

食谱

3 M NaOAc（pH 4.7）
溶解40.8g乙酸钠。 3H 2 O，最终体积为100ml，用冰醋酸调节pH

致谢

该实验室方案是对各种已公布和未公开的方案的自由适应，并且随着时间的推移而演变。我们承认来自CNRS（UPR 9073）和巴黎狄德罗大学，索邦大学的资助。

参考文献

Taverniti，V.，Forti，F.，Ghisotti，D.and Putzer，H。（2011）。耻垢分枝杆菌 RNase J是5'-3'外切 - 核糖核酸酶和核糖核酸酶J和核糖核酸酶E参与核糖体RNA成熟 Mol Microbiol 82（5）：1260-1276。