材料和试剂

2ml RNase，无DNA酶的微量离心管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM12425）
玻璃显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-544-4）
玻璃显微镜盖玻片（Fisher Scientific，目录号：S17525B）
微孔膜过滤器（EMD Millipore，目录号：HAWP04700）
比浊蛋白（荧光光谱）3ml（Hellma，目录号：101-QS）
蓝藻细胞，例如，，Nostoc sp。应变HKAR-2
注意：Nostoc sp。在无氮液体BGA培养基（Safferman和Morris，1964）的无菌条件下，在连续白光（12±2Wm 20±2℃）下，在无菌条件下生长HKAR-2菌株HKAR-2 -2 ）到使用分光光度计中使用石英比色杯测量的0.8至0.9（指数生长期）的OD 750。
指甲油（Lakme）
无水磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
2'，7'-二氯二氟荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma-Aldrich，目录号：D6883）
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
50 mM磷酸盐缓冲液（见配方）
2mM 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）储备溶液（参见食谱）

设备

玻璃培养皿（康宁，目录号：3160-102）
测量缸
295nm UV截止滤光片（Ultraphan，Digefra，Munich，Germany），以促进UV-B（280-315nm），UV-A（315-400nm）和PAR（400-700nm）的期望波段br />
UV-A（Philips Ultraviolet-A TL 40 W：12，Philips Ultraviolet-B TL 40 W：12，Philips Lighting，型号：TL 40W / 12 RS SLV / 25）照明，型号：TL-K 40W / 10-R UV-A）和PAR（55.08±9.18μmol，m -2 sec -1）（OSRAM L 36 W： 32 Lumilux de luxe暖白和镭NL 36 W：26通用白，德国）灯
玻璃棒（Fisher Scientific，目录号：11-380A）
磁力搅拌器（REMI ELECTROTECHNIK，型号：2 MLH）
冷冻离心机（REMI ELECTROTECHNIK，型号：CM-12 PLUS）
振动器
荧光显微镜（NIS Elements（BR）处理的尼康日光镍荧光显微镜）
荧光分光光度计（Agilent Technologies，型号：Cary Eclipse）
分光光度计（日立高科技，型号：U-2900，双光束分光光度计）
石英比色皿（3.5ml）（Cole-Parmer，JENWAY，目录号：035 028）

软件

NIS-Elements（BR）成像软件（尼康）
SigmaPlot 11软件

程序

样品制备的流程图如图2所示

图2.显示协议中涉及的各种步骤的流程图

借助于量筒，将100ml蓝藻培养物转移到无菌玻璃培养皿中。用295 nm紫外线截止滤光片覆盖培养皿，并将其转移到紫外光处理室。
用UV-A，UV-B和PAR辐射蓝细菌，并将室温保持在25±2℃，以避免加热效应。将培养物与玻璃棒定期混合，或使用磁力搅拌器（15-20rpm）以避免细胞的自阴影。
在所需的时间间隔（在12小时和24小时后），通过在室温下以9,050×g离心20分钟，取5ml样品并收获细胞。
将细胞沉淀重悬于1ml磷酸盐缓冲液中（参见食谱）
加入2.5μl溶于乙醇的2mM 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（参见食谱）至样品混合物。
在室温下在黑暗中将样品混合物在振荡器（15rpm）上孵育1小时。
孵育1小时后

对于荧光显微镜：取一张干净的载玻片并加入30微升的培养物。用玻璃盖板盖住电池。用指甲油密封滑块，以免干燥。在荧光显微镜下使用488nm的激发波长显现细胞，并且在500-600nm的范围内检测到发射（图3）。

图3. UV-A + UV-B + PAR暴露的Nostoc 的荧光图像。应答HKAR-2与ROS反应后显示绿色DCF荧光。阴性对照（仅含DCFH-DA;显示基础荧光水平）（A）; 0小时荧光（B）; 12小时UV-A + UV-B + PAR曝光（C）; 24小时UV-A + UV-B + PAR曝光（D）。 PAR：光合有效辐射。比例尺= 10微米。
对于荧光光谱：将3ml液体样品加入到比色皿中进行荧光分光光度分析（图4）。将试管置于荧光分光光度计中，样品在485nm激发。记录在500-600nm的范围内。曝光时间限制在600毫秒，以减少细胞的损伤。在不同持续时间的应激暴露后，根据发射的荧光强度测量荧光

图4.由于在Nostoc sp中UV-A + UV-B + PAR暴露的持续时间变化而产生的ROS反应后的DCF的荧光强度。菌株HKAR-2 （表示±SD，n = 3）。对照：未处理样品。 PAR：光合有效辐射。

数据分析

使用由NIS-Elements（BR）成像软件处理的Nikon eclipse Ni荧光显微镜分析UVR照射的细胞。显微镜配备以下滤光片：UV：（DAPI）EX 340nm EM 488nm，蓝色：（FITC）EX 495nm EM 510nm和绿色：（PI 550）EX 550nm EM 650nm。用20倍物镜在细胞荧光模式下成像细胞。图像分析由尼康提供的NIS-Elements（BR）成像软件进行，图像以JPEG格式保存。此外，通过荧光分光光度计（Cary eclipse，Agilent Technologies）测量样品的荧光，激发波长为485nm，发射带为500至600nm。将荧光光谱数据输出至excel，并提取525nm处的荧光强度值。使用SigmaPlot 11软件绘制条形图。所有荧光测量均在室温下进行。所有结果以荧光分光光度计分析的三次重复的平均值表示，长丝的随机位点用于荧光显微镜。所有数据通过单因素方差分析（Brown，2005）。一旦检测到显着性差异，则使用Tukey检验进行事后多重比较。所有测试的显着性水平为0.05。所有统计分析均采用SigmaPlot 11软件进行。

笔记

应避免将光直接暴露于紫外线处理的样品。
将一次制备的2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的储备溶液保持在-20℃进一步使用，应避免直接暴露于光照（其保持稳定3个月以上）。 br />
所有溶液在使用前通过0.25μm尺寸的Millipore膜过滤器过滤

食谱

50毫克磷酸盐缓冲液（400毫升）
8.7g K 2 HPO 4
6.8g KH 2 PO 4
将pH调节至7.00
使用前过滤0.25μm尺寸的Millipore膜过滤器
2mM（w / v）2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）储备溶液
将0.974mg 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）溶于1ml无水乙醇中，

致谢

Rajneesh和Jainendra Pathak感谢生物科技部（DBT-JRF / 13 / AL / 143/2158）和科学与工业研究理事会（09/013/0515/2013-EMR-I），印度新德里分别以奖学金的形式提供财政支持。 SP Singh分别承认了DST-SERB和UGC的早期职业研究奖和UGC创业研究奖学金。我们也感谢生物科学学院（ISLS），BHU，印度瓦拉纳西，提供荧光显微镜设备的访问。该方案根据Rastogi等人，2010年出版的方法改编。

参考

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