材料和试剂

低体积低结合反应管（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：90410）
Eppendorf管（1.5ml）（Sigma-Aldrich，目录号：T9661）制造商：Eppendorf，目录号：022363204。
PCR管（200μl，NanoTemper Technologies GmbH，Munich，Germany）
移液器吸头（10μl，100μl，1,000μl）（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1111）
拟南芥RNA聚合酶II（Biomatik，Wilmington，Delaware，USA）CTD的FITC标记的肽
注：“pS”表示磷酸化的丝氨酸;在N-末端用异硫氰酸荧光素[FITC，CAS号：27072-45-3]标记肽。
1. CTD-noP（序列：PSYSPTSPSYSP）
2. CTD-Ser2P（序列：TSPSY（pS）PTSPSY）
3. CTD-Ser5P（序列：SYSPT（pS）PSYSPT）
蛋白质SPT6L（Phe1218-Asp1412）
注意：如（Kammel et al。，2013）所述，在具有GST标签的大肠杆菌中表达，并通过谷胱甘肽 - 琼脂糖亲和层析纯化。
来自恶性疟原虫的蛋白质HP1（ P.falciparum ）
注：在具有六聚组氨酸标签的大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL细胞中表达并通过Ni2 + -IMAC层析（Josling等，2015）纯化。 em>
来自果蝇（ D. melanogaster ）的蛋白HP1
注：在具有六聚组氨酸标签的大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL细胞中表达并通过Ni纯化 2 + -IMAC色谱法（Josling等，2015）。
组蛋白肽
所有组蛋白肽均购自ANASPEC，Kaneka Eurogentec（比利时列日）
Pluronic F-127（CAS编号：9003-11-6）（Sigma-Aldrich，目录号：P2443）
十二烷基硫酸钠钠盐（SDS; CAS号：151-21-3）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
磷酸钠（CAS编号：7601-54-9）（Sigma-Aldrich，目录号：342483）
乙二胺四乙酸（EDTA，CAS编号：60-00-4）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
DL-二硫苏糖醇（DTT，CAS号：3483-12-3）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
苯基甲磺酰氟（PMSF，CAS号：329-98-6）（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris，CAS号：77-86-1）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钠（NaCl，CAS编号：7647-14-5）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化镁（MgCl 2，CAS号：7786-30-3）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
吐温20（CAS编号：9005-64-5）（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
NaP缓冲液（见食谱）
MST-T缓冲液（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf Reference 20,100,200,1000）（Eppendorf，产品目录号：4920000032,4920000059,4920000067,4920000083）
MiscroScale热电泳仪Monolith NT.115（NanoTemper Technologies，型号：Monolith NT.115）
MiscroScale热电泳仪Monolith NT.LabelFree（NanoTemper Technologies，型号：Monolith NT.LabelFree）
Monolith NT TM毛细管“高级涂层”（NanoTemper Technologies，慕尼黑，德国）
培养箱（Eppendorf，型号：ThermoMixer®舒适型，目录号：5360000011）
离心机（Eppendorf，型号：5424R，目录号：5404000219）

软件

MO.Control（NanoTemper Technologies，德国慕尼黑）
MO.Affinity分析（NanoTemper Technologies，德国慕尼黑）

程序

解决方案准备
注：缓冲区
1. 对于SPT6L（Phe1218-Asp1412）和拟南芥RNA聚合酶II的CTD肽之间的相互作用，测定缓冲液是NaP缓冲液（参见食谱）。
2. 对于HP1蛋白与组蛋白肽之间的相互作用，测定缓冲液是MST-T缓冲液（见食谱）。
1. 准备工作的解决方案的目标
  1. 肽CTD-noP，CDT-Ser2P和CDT-Ser5P：这些肽用作SPT6L（Phe1218-Asp1412）结合的靶标。
    1. 按照制造商的说明，溶解肽。
    2. 用MST-T缓冲液稀释肽溶液至80 nM，制备目标工作溶液
  2. 来自 P的HP1蛋白。恶性肿瘤和 D。果蝇。这些蛋白质作为不同组蛋白肽结合的靶标。靶标的标记在这种情况下是不必要的，因为它们固有的色氨酸荧光可以与Monolith NT.LabelFree设备一起使用。
    通过在MST-T缓冲液中稀释蛋白质储备液至3.5μM来准备目标工作溶液。
2. 制备配体的工作溶液
  1. SPT6L（Phe1218-Asp1412）蛋白质：该蛋白质用作CTD-肽结合的配体。
    1. 用MST-T缓冲液稀释配体原液至4.3mM。理想情况下，配体的工作溶液浓度应比预计的K / D值高约50倍。
      注意：在4℃下以14,000×g离心配体原液5分钟可能有助于除去聚集体。建议使用低容量低结合反应管（如Thermo Fisher Scientific），以避免分子吸附到管壁上。
    2. 当制备配体工作溶液时，必须考虑到（取决于稀释因子），工作溶液中仍然存在一定量的配体原液缓冲液。如果超过1％，我们建议相应地调整最终的MST缓冲区。
  2. 组蛋白肽：这些肽充当用两种HP1蛋白质靶标进行测量的配体。
    1. 按照制造商的说明，溶解肽。
    2. 在NaP缓冲液中稀释肽溶液至20 mM，制备配体工作原液
3. 配体稀释系列的制备
  1. 配体在200μlPCR管中以16个连续步骤稀释。
    在16个步骤的每个步骤中稀释配体50％（1：1稀释）。
    注意：在控制软件中实现的浓度查找工具可模拟结合数据，并有助于找到稀释系列的正确浓度范围。
  2. 添加10μL检测缓冲液到PCR管2至16
  3. 在PCR管1中填充20μl配体工作溶液。
  4. 将PCR管1中的10μl转移到PCR管2中，并通过上下移液数次来正确混合。
    注意：避免涡流或剧烈摇动，以防止蛋白质变性。
  5. 从PCR管2中将10μl转移到PCR管3中并混合。对剩余的稀释步骤重复此过程。
  6. 丢弃从最后一个管多余的10微升。
    所有16个PCR管应该含有10μl的体积注意：避免任何缓冲液稀释效应是很重要的。所有16个PCR管应含有完全相同的缓冲液组成。如果配体储备溶液与MST测定缓冲液处于不同的缓冲液中，则最佳实践是制备MST测定缓冲液的等分试样，其具有与配体工作溶液的缓冲液完全相同的组成。这个缓冲液然后用于移液连续稀释系列。例如，如果配体原液在缓冲液A + 2mM DTT中并在缓冲液A中稀释10倍以产生配体工作溶液，则工作溶液中的DTT浓度为0.2mM。因此，使用缓冲液A + 0.2mM DTT来制备系列稀释系列。
4. 制备最终的MST混合物
  1. 尽管4μl的体积足以填充MST毛细血管，但建议准备至少20μl的最终MST混合物，以尽量减少移液错误。
  2. 向每个10μl配体稀释步骤中加入10μl目标工作溶液，并通过上下吸移几次来正确混合。
    注意：避免涡流或剧烈摇动，以防止蛋白质变性。
  3. 在室温下孵育五分钟以达到结合平衡。取决于具体的靶标和配体，可能需要更长的温育时间或不同的温育温度。具体的孵育时间和温度必须根据关于要分析的相互作用的先验知识来选择。作为一般建议，我们建议在室温下培养5到20分钟。
  4. 通过将毛细管浸入样品中，用16个MST混合物填充16个毛细管。
    注意：请勿触摸将要进行光学测量的中间部分的毛细管。
  5. 将毛细管放在毛细管托盘上，启动MST设备。
MST测量
1. 启动MST设备
  1. 启动MST控制软件并通过启用温度控制来调节所需的温度。通常在25°C下进行测量。等待温度达到预定值。
    注意：MST仪器可以在22至45°C的温度范围内进行温度控制。
  2. 将毛细管托盘放入MST设备。
  3. 将FITC荧光标记的LED通道（荧光激发）设置为“蓝色”，并将LED电源设置为在具有标准传感器的MST设备处获得300至1,000个单位的荧光信号，在具有高分辨率的设备处获得6,000至18,000个荧光信号，灵敏度传感器。
    注：其他荧光标签可能需要“红色”LED设置。检查使用的荧光团的激发波长。
2. 毛细管扫描
  1. 执行毛细管扫描，以检查样品的不同质量方面。
  2. 检查毛细管扫描，看是否获得最大荧光信号在上述范围内。
  3. 检查毛细管扫描是否有标记的靶向毛细血管玻璃壁的粘连效应。这导致U形或平坦的山峰。
  4. 检查毛细管扫描的移液错误。这导致了16个MST混合物的荧光值不一致。
  5. 检查配体依赖性荧光增强或淬灭效应的毛细管扫描。这些导致随着16 MST混合物中配体浓度的增加而增加或减少荧光值。
3. MST测量
  1. 在开始MST测量之前，确保排除任何粘着效应，移液错误，增强/猝灭效应，并确保足够的荧光信号。
  2. 在对照软件中将16个MST混合物中的每一个与相应的最终配体浓度分配。在较新的控制软件版本中，只设定最高的配体浓度（通常在MST混合物1中），并选择稀释类型（例如1:1或1:2）。
    注意：此时必须输入的配体浓度是上述配体稀释系列浓度的一半，因为稀释样品与目标溶液1：1混合。
  3. 输入荧光标记目标的固定浓度。
    注意：由于上述MST混合物的制备，该浓度也是目标工作溶液浓度的一半。
  4. 对于大多数应用，默认设置（5秒的初始荧光，30秒的热泳记录和5秒的热泳后荧光）就足够了。
  5. 调整MST功率为20％。
    注意：
    1. 为了获得最佳的信噪比并避免非特异性效应，建议使用20-40％的激光功率。在某些情况下，可能需要更高的激光功率来获得未结合和结合分子的良好分离。
    2. 在较新的控制软件版本中，只有MST电源设置“低”，“中”和“高”可用。对于大多数应用程序，建议使用“中”。
  6. 输入将保存实验文件的目标文件夹路径。实验将被保存为.ntp文件。
  7. 开始MST测量。
    。根据设定的时间，测量需要10-15分钟。
  8. 重复MST测量至少两次，以更可靠地确定平衡结合亲和力。
    注意：为了测试测量的技术可重复性，相同的毛细管可以用于多个MST测量。

数据分析

数据分析
1. 启动MST分析软件（MO.Affinity Analysis），并从目标文件夹中加载以前保存的.ntp文件。
2. 选择“MST”分析类型。
  注意：如果毛细管扫描中的初始荧光显示配体依赖性荧光效应的迹象，则也可以选择“初始荧光”分析类型。然而，应该用SD测试仔细研究可能的配体依赖性荧光效应（参见注释）。
3. 通过拖放或单击重复运行下方的“+”按钮，将相应的技术或生物重复运行添加到MST分析。
4. 为了获得有关原始数据，MST曲线，毛细管扫描，毛细管形状曲线，初始荧光和漂白率的信息，请单击相应重复运行下方的“信息”按钮。
  注意：也可以在分析的后续步骤中检查这些原始数据。
5. 检查粘附效应数据的自动检查，以及聚集和/或降水效应。同时目测检查这些效应的数据（例如，U形毛细管形状峰，MST迹线中的凸起和尖峰）。
  注意：这个质量控制步骤的详细描述在注释部分和图2中有描述。
  
  图2. MST实验的测定优化A.毛细管扫描吸附/粘附效应的实例1-3毛细管中的高质量样品4-6。 B.示例MST跟踪显示样本聚合（左图）和高质量数据（右图）。
6. 通过切换到剂量反应面板来评估数据。
  注：正常情况下，标准的评估模式，自动调整确定Fhot和Fcold的时间范围，以保证最佳的信噪比，对于大多数实验来说是足够的。然而，用户也可以自由地将评估模式改变为“专家”，其中可以手动调整用于评估数据的时间范围。
7. 要确定交互的 K D 值，请选择 K / em> '模型。
  注意：虽然'希尔'模型在很多情况下可以更好地适用于数据，但是当被研究的相互作用的已知属性证明时，建议只选择这个模型。例如，这可能是相互作用或合作结合的化学计量比 -1：1。
8. 为了更好地比较不同的MST实验，可以通过以下等式将结合等温线归一化为结合分子（FB）的分数：
  
  其中，是单个MST混合的值，是未绑定状态的值， MST混合物具有最低浓度的配体，并且<！ - SIPO
示例结果
1. 拟南芥RNA聚合酶II的C-末端结构域的短重复肽与SPT6L之间的相互作用
  1. 通过12亚基RNA聚合酶II（RNAPII）合成mRNA（和其他RNA）对于真核生物是非常重要的。因此，RNAPII的转录在转录周期的各个步骤中被调节，包括聚合酶募集以及转录起始和延伸（Kornberg，2007）。重要的是，RNAPII的最大亚基的羧基末端结构域（CTD）在转录周期中被不同地修饰（Buratowski，2009; Jeronimo等人，2016）。 CTD七肽重复的Ser5残基的磷酸化例如在早期延伸期间发生，而当延伸进行时Ser2越来越磷酸化。 RNAPII-CTD的差异修饰对调控染色质模板上的转录延长的因子及与mRNA加工相关的因子（5'端加帽，剪接，3'末端多聚腺苷酸化）（Moore和Proudfoot，2009; Bentley，2014）。同样在拟南芥植物模型中，鉴定了促进RNA印迹抑制染色质RNA转录的多种所谓的转录延伸因子（Van Lijsebettens and Grasser，2014）。这些转录本延长因子的一个亚组是通过在聚合酶途径中分解核小体来辅助RNAPII从而促进聚合酶进展的组蛋白伴侣（Zhou等人，2015）。涉及转录延伸的这些组蛋白伴侣的实例是H2A / H2B伴侣FACT和H3 / H4伴侣SPT6，两者都是由拟南芥中的必需基因编码的（Lolas等人， 2010年; Gu等人，2012年）。 SPT6以称为SPT6L和SPT6的两种变体形式存在于拟南芥中（Gu等人，2012）。在最近的研究中，通过结合质谱分析从拟南芥细胞中亲和纯化来分析RNAPII转录物延长复合物的组成，发现SPT6L（而不是SPT6）是复合物的组成成分（Antosz <等），2017）。由于通过荧光各向异性和NMR研究，由于来自其他生物体的SPT6直接结合到RNAPII-CTD（Sun等人，2010; Liu等人，2011），所以它检查了拟南芥属SPT6L是否也与RNAPII-CTD相互作用。
  2. 使用MST，用差异磷酸化的，合成的，N-末端FITC标记的RNAPII CTD重复肽（Antosz等人，2017）分析推定的SPT6L相互作用结构域（Phe1218-Asp1412）的结合。这个实验中的目标是这样的肽，其不用磷酸化合成，或者在2或5位被磷酸丝氨酸合成，并在其N端残基上用FITC标记。（序列为：CTD-noP（N-PSYSPTSPSYSP-C），CTD-Ser2P（N-TSPSY（pS）PTSPSY-C）和CTD-Ser5P（N-SYSPT（pS）PSYSPT-C） pS）代表磷酸化的Ser残基。该实验中的配体是STP6L相互作用域，其在E中用GST标签表达。并通过谷胱甘肽 - 琼脂糖亲和层析法纯化（Antosz等人，2017）。实验在Monolith NT.115器件上进行，MST功率为40％，LED功率为80％，温度为25°C。
  3. MST测定显示SPT6L（Phe1218-Asp1412）确实能够与合成的CTD肽相互作用，并且对于具有磷酸化Ser2残基的肽具有显着更高的亲和力。该相互作用的K d值被确定为134.8±26.6μM，并且在几个独立的重复中高度重现（图3）。用非磷酸化肽或Ser5-磷酸化肽进行的实验显示出弱得多的结合，并且不可能确定K + D值是不可能的（估计在约1mM的K D ）。重要的是要注意，这不是MST技术的固有问题，而是来自配体原料浓度的结果，其配体原料的浓度太低，不能分析具有更高配体浓度的MST混合物（MST中最高可能的最终配体浓度混合物是2.15mM）。因此，MST测定显示来自拟南芥的SPT6L的相互作用结构域也直接结合于RNAPII-CTD，如之前已经显示的来自其他生物体的SPT6L蛋白质。此外，测定显示SPT6L对于RNAPII的Ser2-磷酸化CTD重复肽的亲和力比对于非磷酸化或Ser5-磷酸化CTD至少高10倍。这些实验展示了MST如何成功应用于研究复杂的真核蛋白复合物亚基之间的相互作用。
    
    图3.GST-SPT6L（Phe1218-Asp1412）与atRNAPII-CTD的三个重复肽之间的相互作用的MST分析。在该实施例中，蛋白质SPT6L（Phe1218-Asp1412）充当未标记的配体，并且以递增浓度添加到用作靶的三种FITC标记的肽中。这些肽类似于拟南芥RNA聚合酶II的C-末端结构域的特定区域，并且在Ser2（红色）或Ser5（蓝色）上是非磷酸化（绿色）或磷酸化的。将原始荧光数据标准化为结合靶标的分数。误差线表示三次重复测量的标准偏差。根据质量作用的规律，从与模型的拟合中确定了K R 2 = 0.98）。该图从Antosz et。，2017（ www.plantcell.org ，美国植物生物学家协会版权）。
2. 组蛋白尾肽与HP1蛋白之间的相互作用
  1. 真核生物基因组通常被组织成染色质，一种围绕脚手架蛋白质的紧密的DNA存储形式。染色质的最低水平是核小体，它是由约150个核苷酸的DNA片段（Kornberg，1974; Luger等，1997）环绕的组蛋白的八聚体复合物。组蛋白单体具有灵活的N-末端尾部，这是经常发生翻译后修饰的位点，如乙酰化，甲基化或磷酸化。这些修饰的频率和性质是染色质结构和DNA可及性的重要调节因子（Jenuwein和Allis，2001）：修饰的组蛋白尾巴可以影响相邻核小体之间的相互作用并且可以招募其他影响染色质结构的蛋白质（Shogren-Knaak等人，2006）。一种这样的“读取器”蛋白是异染色质蛋白1（HP1），一种小的（约30kDa）高度保守的蛋白质，其特异性结合甲基化的组蛋白，例如组蛋白H3的组蛋白尾肽，在Lys9（H3K9met）处的甲基化（Eskeland等人，2007）。 HP1与甲基化组蛋白尾部的结合是表观遗传学调控中的一个重要因素，也是形成异染色质（即染色质区域）的低转录活性和高致密比（Kwon and Workman，2011）。 />
  2. MST使得研究人员能够确定HP1蛋白和组蛋白尾部在溶液中（而不是任何固定化）和无标记（ ie ）之间的相互作用的典型相互作用参数，而不需要将荧光标签附加到交互伙伴之一）。因此，它提供了在与相互作用的生理条件非常接近的系统中研究这些相互作用的可能性。这是可能的，因为短的组蛋白尾肽不含有荧光氨基酸，同时我们研究的HP1蛋白含有足够的Trp和Tyr残基，以产生可用Monolith NT测量的可靠的内在荧光信号。 LabelFree MST设备。我们用四种不同的组蛋白H3（20个氨基酸）的尾肽分析了两种HP1同系物（来自恶性疟原虫和黑腹果蝇）之间的相互作用：一种未修饰的肽，（在Lys4和Lys9处）和一个乙酰化肽（在Lys9处）。
  3. 对于每个实验，HP1蛋白作为靶标，并以3.5μM的最终恒定浓度使用。该肽用作配体，并以10nm至10mM的最终浓度进行测定。 Monolith NT.LabelFree被设置为20％的LED功率和40％的MST功率，具有30秒的热泳时间间隔。将原始荧光数据标准化为结合配体的分数，并用描述质量作用定律的“KD”模型拟合。来自 P的HP1。恶性疟原虫（pfHP1）结合具有4.36±0.14的KD值的二甲基化肽H3K9（Me2） μM（图4A）。另外的实验显示这种相互作用是高度特异性的，因为pfHP1不结合仅在甲基化赖氨酸残基（H3K4（Me2））的位置上不同的另一个二甲基化肽，也不结合乙酰化的肽（H3K9（Ac））或未修饰的肽（H3）（图4B）。我们还可以证明，这种相互作用的特异性是保守的，因为也有来自 D的HP1。 melanogaster （dmHP1）显示相同的结合偏好（图4C和4D）。然而，与H3K9（Me2 / 3）相互作用的KD高约7倍（31.12±0.48μM）。 />
  4. 这些实验也证明用MST确定的结合等温线是高度可靠的。来自结合实验的几个单独重复的标准偏差是低的，并且确定的K D值是高度可重现的（图4A和4C）。此外，pfHP1和H3K9（Me2.4）（4.36μM）之间相互作用的K d值非常吻合由ITC确定的7μM（Jacobs和Khorasanizadeh，2002）。这表明MST非常适合于研究表观遗传系统中的相互作用。重要的是，测量可以在溶液中进行，样品消耗非常少（在使用真核蛋白质或合成肽时需要考虑的重要一点），也可以在生物液体中进行。因此，这项技术可以快速，简单，灵活地表征各种组蛋白 - 读数蛋白相互作用。
    
    图4.恶性疟原虫与恶性疟原虫之间相互作用的MST分析。黑色素瘤 HP1和使用无标记MST技术的不同组蛋白肽。来自恶性疟原虫（pfHP1）和 D的HP1蛋白。黑腹果蝇（dmHP1）作为本例中的目标。在这个例子中，没有必要附加荧光标签的目标，因为这两种蛋白具有足够高的摩尔消光系数来分析Monolith NT.LabelFree设备上的相互作用。一个先决条件是组蛋白肽不含色氨酸和酪氨酸残基（在300nm以上没有荧光）。

笔记

检测吸附和毛细血管粘连的效果和故障排除
毛细管扫描可以检测目标和毛细管玻璃表面之间发生的粘附或吸附效应。不规则的峰形（如图2A，毛细管1-3），如U形或扁平的峰，表示粘附或吸附效应。在许多情况下，改变毛细管类型（标准处理，优质涂层或疏水）可以防止它们，导致形成规则的峰（图2A，毛细管4-6）。如果毛细管类型的改变不能增强毛细管扫描峰形，缓冲条件的变化或添加洗涤剂如吐温（0.005-0.1％）或Pluronic F-127（0.01-0.1％）可防止粘附和吸附。通常，在测量全部16个MST混合物之前，应该用一个MST混合物进行毛细管测试，以便找到不发生粘附和吸附的条件。
这个阶段的MST实验对于高质量的数据质量至关重要
检测荧光效应和故障排除
1. 最初的毛细管扫描还提供了有关可能的移液错误或配体依赖性荧光发射变化的信息。移液误差反映在毛细管峰的随机高度差异中。高移液精度是强制性的，以避免这种错误。另外，应该避免缓冲液稀释效应，即，用于制备稀释步骤的缓冲液应该与配体工作溶液的缓冲液完全相同。单个毛细血管之间荧光读数的巨大差异也可能是样本聚集的标志。聚集体的特征在于更高的荧光密度，从而在进入光学读出焦点时增加荧光读数。
2. 然而，与配体浓度相关的荧光信号的系统变化暗示了配体可能的荧光增强或猝灭作用。为了排除其他可能性，如非特异性荧光降低，对于这些系统变化，进行了SD检验：如果荧光的系统变化实际上是配体依赖性的，则该变化在变性条件下不可检测到，并且荧光信号对于所有毛细血管应该是相同的。然而，如果荧光信号在变性条件下仍然显示出偏差，原因可能是荧光标记的分子由于吸附，粘附或聚集效应而损失。标准的SD-测试如下进行：将10μl第一个MST混合物和10μl最后一个MST混合物各自转移到含有10μl2×SD混合物（4％SDS，40mM DTT）的新鲜PCR管中，。混合后，样品在95℃孵育5分钟以确保变性。新鲜的毛细血管被填满，荧光强度被记录在与之前相同的设置。
检测聚合效果和故障排除
样品聚集和/或降水可以很容易地在MST迹线中检测为隆起和尖峰（图2B，左图）。没有聚合的样品通常显示平滑的MST迹线（图2B，右图）。如果在样品中发生聚集，则改变毛细管类型，缓冲条件和添加剂如洗涤剂（0.005-0.1％Tween-20,0.01-0.1％Pluronic F-127或类似物）或BSA（> 0.5mg / ml ），pH条件和盐浓度可以优化分子的溶解度。通过离心测量可以除去大的聚集体（至少10分钟，14,000×g克）。为了确保最佳的数据质量，MST迹线应该类似于图2B右侧面板中显示的迹线。
数据分析和曲线拟合
1. 原则上，可以根据不同的潜在物理现象评估MST迹线。温度跃变（或T跳跃）描述了如果荧光发射随温度变化而发生突然变化，这对于不同荧光团而言通常是特征性的。 T跳跃受到配体在荧光团附近的结合的高度影响。 MST曲线的较慢热泳相受到分子沿感应温度梯度的移动的影响，因此对所研究分子的大小，电荷和水合壳的变化高度敏感。
2. 在MO.Affinity分析软件的“专家”分析模式中，用户可以改变T跳跃或热泳评估的时间点。如果样品中发生聚集，并且上述说明不能解决这些问题，则有可能使用热泳阶段的早期部分，其中聚集效应可能小于后面的部分。检查热泳相的早期部分也可以提高数据质量，因为毛细血管内的对流效应不明显。
3. MO.Affinity分析软件为拟合剂量反应曲线提供了两种选择。 “ D ”模型基于质量作用定律：
  
  其中，T 是标记的靶标，而 L 是非荧光配体。
  依赖于滴定配体浓度的荧光信号（ f ）可以是计算如下：
  
  其中，和是在未绑定状态和绑定状态下的荧光值，以及和 c T 是形成的复合物的浓度和荧光标记的目标的固定浓度。
  从分数边界值 D 可以派生出来：
  
  其中，K 是解离常数。
  请注意，此拟合模型仅适用于描述目标T与具有一个特定结合位点的配体L或具有相同亲和力的多个结合位点之间的1：1相互作用的数据。 “Hill”模型允许确定交互的EC50值：
  
  在这种情况下，分数界限如下：
  
  其中，是滴定的非标记配体的浓度。
  请注意，“希尔”模型通常用于与协同绑定的交互。它不应该用于拟合可以用群众行动规律来清楚解释的数据。此外，“希尔”模型仅确定分子相互作用的EC 50值，其中50％的目标分子结合的配体的浓度。知道EC50值不直接对应于解离常数K 是很重要的。
  对于一个特定的实验来说，这更多的是一种明显的亲和力，它取决于所使用的浓度和条件
检测低荧光团浓度
低于1nM的标记靶的浓度通常需要高的激发光强度（Monolith NT.115微微上的LED功率> 75％（或“高”））。如此高的强度会导致荧光团的明显的漂白，并因此给数据带来额外的噪音。 NanoTemper Technologies提供的抗漂白剂套件可以帮助减少这些影响。
关于温度梯度
温度梯度跨度为2°C，MST功率为20％，温度梯度为6°C，MST功率为80％。加热样品的总体积是2 nl。建议通过使用单个毛细管和不同的MST功率设置（例如20％，40％和80％）进行多次测量，在全结合实验之前确定最佳的MST功率。

食谱

NaP缓冲区
10mM磷酸钠pH 7.0
1 mM EDTA
1 mM DTT
0.5毫米PMSF
MST-T缓冲区
50mM Tris-HCl pH 7.8
150 mM NaCl
10mM MgCl 2•/ 2 0.05％Tween-20

致谢

我们感谢Corinna Kuttenberger和Clemens Entzian提供专家科学和技术援助。

参考

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