材料和试剂

15ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339650）。
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：178905）。细胞培养瓶（T-烧瓶）80cm2
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：178883）。
细胞刮刀（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：179707）
10ml血清移液管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：170356）
1.5ml微量离心管（Corning，Costar ，产品目录号：3622）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：167008）
移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：21-402-269,21-402-569,21-402-589）
制造商：Thermo Fisher Scientific，目录号：3752RI，3782RI。
一次性计数室（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450003）
颗粒杵（Fisher Scientific，目录号：12-141-364）
飞蝇瓶（Genesee Scientific，Flystuff，目录号：32-116SB）
（Leishmania amazonensis）（菌株RAT / BA / LV78，Dutta等人，2005）。
BALB / c骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）
注：材料和试剂在Chen，2013的Bio-protocol paper中描述。Balb / c小鼠从The Jackson Laboratories获得。一只小鼠的股骨和胫骨产生大约3×10 8巨噬细胞。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-031-CV）
RPMI 1640（Corning，目录号：10-040-CV）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
溴酚蓝（Fisher Scientific，目录号：BP115-25）
飞行食品（FlyStuff Nutri-Fly糖蜜配方或Nutri-Fly TM布卢明顿配方，Genesee Scientific，Flystuff，目录编号：66-116）
黄色玉米面飞蝇食品（Genesee Scientific，Flystuff，目录号：62-101）
Schneider昆虫培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21720024）
青霉素/链霉素（Corning，目录号：30-002-Cl）
Tetracyclin（Sigma-Aldrich，目录号：T7660）
衣霉素（Cayman Chemical，目录号：11445）
70％乙醇
199媒体（康宁，目录编号：90-050-PB）
热灭活的胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物公司，目录号：S12450）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3784-100G）
琥珀酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9637）
Hemin（Sigma-Aldrich，目录号：H9039）
胰蛋白酶大豆肉汤（BD，目录号：211825）
199媒体生长promastigotes（见食谱）
199 promastigote媒体为axenic amastigote分化（见食谱）

设备

装备有用于15ml锥形管的摆动桶的离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall TM Legend TM RT） br />
培养箱（VWR 水夹套CO 2培养箱）
玻璃反弹与研磨室和聚四氟乙烯棒，清除0.004“至0.006”（DWK生命科学，惠顿，目录号码：358011）
血细胞计数器Hausser Scientific Bright-Line TM计数室（Hausser Scientific，目录号：3110）
毛细管拉拔器（NARISHIGE，型号：PC-100）
纳升注射器（Drummond Scientific，型号：Nanoject II）
用于Nanojet II的Drummond Scientific毛细血管（Pipette.com，目录号：3-000-203-G / X）
制造商：Drummond Scientific，目录号：3-000-203-G / X。
电子卡尺（Mitutoyo，目录号：500-197-30）
（Genesee Scientific，FlyStuff，目录号：59-114）
立体显微镜（尼康仪器，型号：SMZ645）
多道移液管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Finnpipette TM F2）
Pellet研磨机（Fisher Scientific，目录号：12-141-361）
精密镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-122）
配备成像系统（相机：Nikon Instruments，型号：Ds-Qi1，成像软件：NIS-Elements）的荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse E400）

软件

成像软件：NIS元素基础研究，显微镜成像软件（尼康仪器）
GraphPad Prism7（GraphPad软件）
CellProfiler细胞图像分析软件（ www.cellprofiler.org ）

程序

利马尼亚文化，以产生无ama癖
1. 解冻与鞭毛细胞的小瓶，并在补充10％胎牛血清和3微克/毫升衣霉素（DsRed表达的选择标记）10毫升199培养基（见食谱）培养。在26℃下，在80cm 2的T-烧瓶中开始1×10 6个寄生虫/ ml培养物3天。寄生虫积极繁殖现在＆gt;第三天90％的生存能力。
2. 在15毫升锥形管中离心培养700毫克/克10分钟
3. 去除上清液，并在199培养基中重新悬浮寄生虫（参见配方2），最终浓度为10 7寄生虫/ ml。将寄生虫转移到T型瓶。
4. 将培养物在34℃培养3-4天，以使前鞭毛体分化为无鞭毛体。早在分化诱导后1天即可见到具有无鞭毛体形态的寄生物（卵形和无细胞外鞭毛）。但是，寄生虫需要3天才能完成分化。
  注意：Axenic amastigotes通常用于研究，但它们与细胞内的无鞭毛体不相同（Gupta et al。，2001）。
5. 700×g离心10分钟。用10毫升PBS洗涤。重复洗一次。
6. 将1×10 8个寄生虫转移到在175cm 2 T-烧瓶中培养的Balb / c BMDM培养物（2×10 7 BMDM /瓶）。
7. 将培养物保持在34℃，并每5天用添加有10％FBS的新鲜RPMI 1640进料细胞。
从BMDMs收获amastigotes
1. 从感染的培养液中取出培养基，加入5 ml的PBS，并在感染一周后用刮刀分离细胞。将细胞悬液转移到冰冷的玻璃Dounce组织研磨机上，上下移动棒20次以破坏细胞，施加轻微的压力，同时将玻璃Dounce保持在冰上。在大的寄生泡中发现大量的无鞭毛体（图1A），然而连续的寄生虫增殖杀死巨噬细胞并在纯化后逐渐降低寄生虫产量。
  
  图1.细胞内亚马逊L. amazonensis 从巨噬细胞中分离无A. A. balb / c BMDM感染无菌无鞭毛体7天，表达DsRed的无鞭毛体居于大的寄生液泡中。 B.清洁从感染的BMDMs收获的无辜者。比例尺= 10微米。
2. 将裂解物转移至15ml锥形管中，用冷PBS将体积加至13ml。
3. 在210℃下离心8分钟，4℃并将上清液转移到新鲜的15ml锥形管中。丢弃含有完整巨噬细胞和大碎片的颗粒。
4. 将收获的上清液在675×g下离心12分钟，4℃。
5. 弃去上清液，重悬于3ml 25％Percoll垫（750μlPercoll，300μlFBS和1.95ml RPMI 1640）中的沉淀。
6. 3000×g离心15分钟，4℃。
7. 用血清移液管移出上清液，将沉淀重悬于3ml冷PBS中，并在800xg离心12分钟以清洗寄生虫。
8. 重悬在1毫升RPMI的寄生虫和计数使用hemocytometer的amastigotes。在典型的制备中应该获得5-10×10 7个寄生虫。图1B显示了使用这个协议获得的amastigotes。
9. 将寄生虫悬浮液转移到微量离心管中，并在800×g下离心12分钟。
10. 在PBS中重悬沉淀至浓度为1.25×10 9寄生虫/ ml，用于飞注射。
飞注射
1. 使用7到10天的苍蝇生长在宽飞蝇瓶（25苍蝇/小瓶）在25°C。
2. 在感染前将动物保持在29°C 3天，以优化UAS-GAL4系统效率
3. 使用毛细管拉拔器准备针头并使用电子卡尺测量针头的直径，将毛细针头折断至直径约60μm。一个快速提示是用大约第一对腿的股骨直径做针。
4. 按照制造商的说明将毛细血管针装配到Nanoject（Drumond）上。
  注意：使用适当的个人防护装备，并特别小心，以避免尖锐的玻璃针头发生意外。
5. 将程序B中获得的寄生虫悬浮液涡旋几秒钟，并加载约2mm的针头。
6. 在立体显微镜下的CO 2垫中麻醉苍蝇。
7. 调整喷油器，每次喷射处理32.2 nl。将寄生虫悬浮液加载到显微注射器上，并在第一和第二腹部之间的苍蝇侧面注射寄生虫（视频1）。监测注射检查腹部的扩张。
  注射5秒钟后，丢弃腹部明显膨胀的苍蝇
8. 将注射的昆虫转移到新鲜的小瓶中并密封。
9. 在启动新的样品瓶之前更换针头，以避免不同样品瓶的苍蝇之间发生交叉污染
10. 准备注射了PBS的对照组，并且每只苍蝇应注射未注射以公正地评价感染对存活的影响。
  
  视频1
定量方法1：生存测定
野生型苍蝇轻微易受L型影响。亚马逊（amazonensis）感染，在15天的实验过程中具有70-80％的存活率，但是易感菌株可能在血淋巴中呈现不受控制的寄生虫增殖并且存活减少（Okuda等人， 2016）。
1. 理想情况下，每个条件至少使用50个苍蝇，用于统计功效。在2个小瓶中分配50个苍蝇用玉米面飞食物。这餐的黄色可以很容易地检测到苍蝇。
2. 在感染后10-15天监测死苍蝇每天一次。每隔2-3天将幸存的苍蝇移到新的小瓶中，或者当许多苍蝇坐在小瓶底部时，使计数过程变得模糊。
3. 使用生存函数在Prism GraphPad中绘制数据。实验苍蝇的Kaplan-Meier生存曲线应该与用PBS注射的相同果蝇和用相同制备的寄生虫注射的WT苍蝇进行比较。比较可以使用Log-rank（Mantel-Cox）测试来执行。图2显示了典型的生存实验的结果，其中缺乏吞噬细胞的苍蝇也被称为Phago sup-less（HmlΔGal4-eGFP，UAS-Bax，Defaye等人，2009）更易受到用寄生虫或用PBS注射的Phago 苍蝇攻击的WT苍蝇的影响。
  
  图2.注射 L. amazonensis amastigotes的苍蝇的生存。与野生型苍蝇相比，没有血细胞的苍蝇（Phago
定量方法2：通过有限稀释确定寄生虫负荷
在该测定中，将感染的苍蝇匀浆，并将一部分悬浮液连续稀释于Schneider's昆虫培养基中，培养7天，并在显微镜下评估增殖的前鞭毛体的存在。
1. 用100μl补充有10％FBS，50U / ml青霉素/链霉素溶液，10μg/ ml四环素和5μg/ ml衣霉素（DsRed寄生物是衣霉素抗性的）的Schneider's昆虫培养基填充三个96孔板，。添加一个额外的80微升媒体的第一行将是第一个稀释孔。
  高剂量的抗生素对于减少苍蝇中存在的细菌的生长至关重要
2. 在发动机罩内，使用精密的镊子，从CO 2垫上挑一只苍蝇，迅速将其浸入70％的乙醇中，然后在无菌水中浸两次。将干净的苍蝇放入含有200μlPBS的1.5ml微量离心管中。
3. 使用颗粒研磨机轻轻研磨苍蝇10秒，以破坏外骨骼并释放血淋巴和组织中的寄生虫。
4. 等待5分钟以沉淀底部的大组织，并将20μl顶部苍蝇匀浆转移到第一个孔中一式三份。
5. 使用多道移液器，通过将100μl的一个孔转移到下一个孔中进行24次稀释（直到使用3个板的所有孔），进行系列稀释。改变移液器吸头的前5个稀释度，然后每3个稀释度，以避免寄生虫在尖端遗留。
6. 在27℃7天后，在光学显微镜下检查活的前鞭毛体的存在。计算每个系列中的正孔数量并将其转换为稀释因子（第一个孔=一次的1/20）。
  提示：培养过程中，保持培养板的一侧高出约5mm，这样寄生虫将集中在培养孔的同一侧，便于识别阳性孔。
定量方法3：从感染的苍蝇直接观察寄生虫
这种方法可以用来估计苍蝇感染寄生虫表达荧光蛋白，如DsRed的寄生虫负担。
1. 轻轻研磨一个苍蝇在40微升施耐德的昆虫介质在一个1.5毫升的微型离心管使用颗粒研磨机10秒，并让其静置5分钟沉淀大型碎片。我们建议每个样本使用至少10个苍蝇用于统计功效。
2. 加载2改进Neubauer或类似的一次性计数商会与顶部悬挂。
3. 使用具有10倍物镜的荧光显微镜对表达DsRed的寄生虫进行成像。每个房间4个图像进行寄生虫计数（共8张图像）。
4. 使用诸如开源CellProfiler（Carpenter等人，2006）的细胞图像分析软件调整设置以根据大小和荧光精确地鉴定寄生虫。图3显示了一个简单的Cell Profiler管道的例子。
5. 将每个图像的平均寄生虫数乘以1.82×10-4，计算每毫升寄生虫数，然后乘以0.04（总体积40μl），计算每只寄生虫的总数。如果使用不同的成像设置，请考虑图像的实际尺寸和计数室的深度来调整此公式。
  
  图3.使用CellProfiler计数飞行匀浆中的寄生虫。将感染2天的苍蝇匀浆加载到计数室中并使用荧光显微镜成像。使用Cell Profiler软件分析图像。左侧窗口显示用于识别图像中寄生虫的设置。右边的窗口显示输入的原始图像，带有已识别的寄生虫（彩色）的图像，并在底部，图像突出显示所有已识别的对象（寄生虫以绿色圈出）。

数据分析

对于苍蝇存活实验，将实验苍蝇与具有相同遗传背景的相同寄生物制剂注射的野生型果蝇进行比较，并将苍蝇注射PBS（载体）。这个细节是重要的，因为一些突变苍蝇可能容易受伤，并在注射PBS后死亡。统计显着性由Log-rank（Mantel-Cox测试）确定。
对于通过有限稀释和直接计数确定的寄生虫负荷，使用单向ANOVA将每10个实验苍蝇的重复与感染相同寄生虫制剂的WT苍蝇进行比较。
我们进行至少3次独立实验用于体内实验。此外，表现出感兴趣表型的苍蝇线通过3个另外的独立分析进行验证。
用GraphPad Prism7进行统计学检验。 R等免费软件也可以用来执行这种类型的分析。

食谱

199媒体增长promastigotes
199媒体补充：
10％FBS
20毫米HEPES
0.35克/升碳酸氢钠
5μg/ ml氯化血红素（来自0.1N NaOH中的0.2％血红素的储备溶液），pH7.4
199媒介诱导promastigote到axenseic amastigote分化
199媒体补充：
20％FBS
20毫米HEPES
0.35克/升碳酸氢钠
5μg/ ml氯化血红素（来自在0.1N NaOH中的0.2％血红素的储备溶液）
40毫克琥珀酸钠
0.5％胰蛋白大豆肉汤，pH 5.4

致谢

该协议已被改编自Okuda等人，2016年。由NIH（R21AI109678）支持NS。作者声明不存在利益冲突。

参考

Brand，A.H。和Perrimon，N。（1993）。靶向基因表达作为改变细胞命运和产生显性表型的手段。开发 118（2）：401-415。
木匠，AE，琼斯，TR，Lamprecht，MR，克拉克，康，IH，Friman，O.，Guertin，DA，Chang，JH，Lindquist，RA，Moffat，J.，Golland，P.和Sabatini， DM（2006）。 CellProfiler：用于鉴定和定量细胞表型的图像分析软件 Genome Biol 7（10）：R100。
陈，R.（2013）。小鼠骨髓巨噬细胞（BMM'phi'）的分离和培养 Bio Protoc e68。
Defaye，A.，Evans，I.，Crozatier，M.，Wood，W.，Lemaitre，B。和Leulier，F。（2009）。果蝇吞噬细胞的遗传消融揭示了它们对发育和抗性的贡献细菌感染。 J Innate Immun 1（4）：322-334。
Dutta，S.，Ray，D.，Kolli，B.K。和Chang，K.P.（2005）。利用铝酞菁在细胞外和细胞内两个阶段对亚马逊利什曼原虫进行光动力学致敏氯化物在体外光解。 Antimicrob Agents Chemother 49（11）：4474-4484。
Gupta，N.，Goyal N.和Rastogi，A.K。（2001）。利什曼原虫无菌无鞭毛体的体外培养和表征< / em>。趋势Parasitol 17（3）150-153。
Okuda，K.，Tong，M.，Dempsey，B.，Moore K.J.，Gazzinelli，R.T. Silverman，N。（2016）。利什曼原虫amazonensis 使CD36驱动寄生泡的成熟。 PLoS Pathog 12（6）：e1005669。