材料和试剂

具有锥形底部的50ml聚丙烯离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
50 ml带PTFE衬里酚醛盖的玻璃螺旋盖离心管（AGC Techno Glass，目录号：8422CTF50）
9英寸玻璃巴斯德移液器（AGC Techno Glass，目录号：IK-PAS-9P）
TLC硅胶60块20×20厘米的玻璃板（Merck，目录号：105721）
色谱滤纸1CHR 200 x 200 mm（GE Healthcare，目录号：3001-861）
玻璃微毛细吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z543292）
具有22s / 51/2针（Hamilton，目录号：7758-03）的100μl微型注射器（1710 RN，Hamilton，目录号：81030）
14毫升带PTFE衬里酚醛盖的玻璃螺旋盖试管（AGC Techno Glass，目录号：TST-SCR16-125）
大开口小瓶的容量为0.15 ml（Sigma-Aldrich，目录号：24719）
2毫升带开口螺帽（Sigma-Aldrich，目录号：29116-U）的大开口小瓶
ULBON HR-Thermon-3000B GLC毛细管柱I.D. 0.25×25米（信和化学工业）
Chlorella kessleri 11 h，相当于NIES收集的： hlorense http://mcc.nies.go.jp/ ）（国家环境研究所，目录号：NIES-2160）
氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
丁基羟基甲苯（BHT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-07392）
甲醇（CH 3 OH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：138-06473）
氯仿（CHCl3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：033-08631）
Primuline（C 21 H 15 N 3 O 3 S 3）（东京，日本）化学工业，目录号：P0603）
丙酮（CH 3 = COCH 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-00346）
作为TAG标准品（Wako Pure Chemical Industries，目录号：200-03002）的三棕榈酸甘油酯（C15H9N6O6）
N 2气体
氯化氢 - 甲醇试剂（5-10％）（Tokyo Chemical Industry，目录号：X0041）
-Hexane（C 6 H 14）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：084-03421）。
Supelco 37组分FAME混合物（Sigma-Aldrich，目录号：47885-U）
Gamborg的B5中等盐混合物（Nihon Pharmaceutical，目录号：399-00621; Gamborg等人，1968）
山梨醇（C 6 H 14 O 6）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：198-03755）
花生酸（C 20 H 40 O 2）（Tokyo Chemical Industry，目录号：E0006）
1 / 4GB中或不含0.6M山梨糖醇（见食谱）
花生酸溶液作为IS（见食谱）

设备

高压蒸汽灭菌器（TOMY SEIKO，型号：LBS-245）
配备ST-720M旋转转子（16×50毫升）的台式离心机（Kubota，型号：5220）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
旋转式蒸发器（东京Rikakikai，型号：N-1110V-W）配有螺旋盖管接头
紫外透射仪（UVP，型号：LM-20）
通风柜（大和科学，型号：KFS）
强制空气流动烤箱（东京Rikakikai，型号：WFO-451SD）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 640）
双槽TLC室20×20厘米板（Camag，目录号：022.5256）
装有分流/不分流进样器，框架离子检测器（FID）和自动注射器的毛细管气液色谱仪（岛津制作所，型号：GC-2025）
Chromatopac积分仪（岛津，型号：C-R7A plus）
玻璃层析试剂雾化器（Corning，PYREX®，目录号：2153-125）

程序

总脂质提取
1. 文化 C。 kessleri细胞在30℃下在100ml的1/4 GB（见配方）中没有山梨醇，在照射下（30Wm -2）和通气48-72小时至增长的指数后期（在730nm处的光密度值[OD 730℃]在0.4-0.6之间）。
2. 通过在2×50ml试管中1500×g离心15分钟在室温（台式离心机）中收获细胞。通过滗析弃去上清液并将细胞重悬于20ml含0.6M山梨糖醇的1/4 GB的GB中以诱导TAG积累（Hirai等人，2016）。
3. 通过在1500×g离心15分钟收获细胞。弃去上清液，用0.6M山梨糖醇将细胞重新悬浮在20毫升1 / 4GB的细胞中。重复该离心 - 再悬浮步骤两次，最后在0.6M山梨糖醇的50ml 1/4 GB的细胞培养物的OD 730值调节至0.3。在相同的生长条件下培养细胞三天。
4. 通过在室温下1,500×g离心15分钟来收获细胞。通过倾析弃去上清液并将细胞重悬于2ml 0.1M KCl中。
5. 将细胞悬浮液转移到带有PTFE衬里的酚醛盖的玻璃螺旋盖离心管（50毫升容积）中。向样品中加入6.0ml甲醇和30μl1.0％（w / v）BHT的甲醇溶液作为抗氧化剂，用涡旋混合器以最大速度搅拌30秒以使细胞膜系统不稳定。 >
6. 向样品中加入3.0ml氯仿。用漩涡混合器以最大速度搅拌30秒，静置10分钟以从细胞中提取脂质。
7. 再次加入3.0ml氯仿，搅拌样品，用涡旋混合器以最大速度强化萃取脂质30秒。
8. 加入3.0ml蒸馏水并涡旋30秒以使样品乳化。在室温下，将混合物在1000×g下离心5分钟，使其分离成三相，即H 2 O的上相和甲醇，细胞碎片的中间相和氯仿的下层相。
  在管底部没有细胞碎片
9. 用巴斯德移液管将包括总脂质的下层相转移到具有PTFE衬里的酚醛盖的玻璃螺旋盖离心管（50ml体积）中。小心不要拿起细胞碎片或上层相。剩下的下一阶段可以通过后续程序恢复。
10. 向剩余的上，中相添加3.0ml氯仿，并用涡旋混合器搅拌混合物30秒。
  在室温下1000×g离心15分钟。
11. 在步骤A9将下层相回收到玻璃管中。
12. 重复步骤A10到A11两次，直到脂质完全恢复。通过观察细胞碎片的漂白来确认脂质的完全回收，这是由于将绿色叶绿素提取到下层相中所致。
  注意：由于机械破坏不会增加TAG回收率，但是由于内源性脂肪酶的作用，游离脂肪酸的出现可能会降低TAG含量，因此在脂质提取之前不要机械地破坏C. kessleri细胞。
13. 如有必要，用旋转蒸发器完全蒸发溶剂，加入甲醇或氯仿/甲醇（2:1，v / v）以通过共沸除去残留的H 2 O.称取干燥的残余物并溶解200μl氯仿/甲醇（2:1，v / v）中的脂质并将该总脂质部分转移到玻璃小瓶中以在-20℃保存直到使用。干渣重量的值将有助于优化总脂质在TLC板上的加载以更好地分离TAG。
通过TLC从其他脂质类别中分离TAG
1. 通过在其壁上放置一张滤纸，然后通过将展开剂己烷/乙醚/乙酸盐（70:30:1，v / v）倒入一个TLC室来分离TAG 。深度1厘米。关闭蒸汽饱和的盖子，这是由浸泡在溶剂中的滤纸促进的。在开发开始之前，将腔室放置一小时或更长时间以使溶剂蒸气饱和。为了确保可重复性，每次分析都要新鲜制备溶剂。
2. 将TLC硅胶60板在烘箱中在120℃下加热几个小时以在显影之前激活硅胶。
  在这个过程中，请勿用手触摸板子
3. 用碳素铅笔画一条距薄层板底部约2厘米的水平线，在水平线上画出一个水平长的矩形（ ca。 2 x 3 cm）盘子。线必须轻轻拉伸，以避免刮擦硅胶。不要使用墨水笔，否则线条会消失。
  注意：根据样品的数量，TLC板可以在使用前切成两块（10厘米宽）。
4. 用玻璃微毛细管吸取器或100μl微量注射器用22s / 51/2针将45％存储的总脂质部分施加到矩形斑点上，并风干。重复这个步骤几次，直到这个分数完全转移到这个地方。
5. 在分析物样本点旁边的水平线上涂抹5-25μl标准TAG储备溶液（1 mg / ml氯仿，w / v）。
6. 将TLC板置于室中，用盖子覆盖室，使板展开，直到溶剂上升到板上侧约2cm。
7. 拆下培养皿中的培养皿，风干培养皿
8. 在通风橱中用丙氨酸（0.01％，在80％丙酮中，w / v）喷洒板，并在365nm紫外光下照射以检测呈现浅色的脂质化合物（见图1）。
  从TAG标准的位置判断，用铅笔概述TAG点注意：为防止TAG斑点扩散，应避免喷洒过量的检测试剂。
9. 通过微刮刀的平坦边缘去掉TAG斑点的硅胶。应立即处理来自TAG的硅胶以生产脂肪酸甲酯（FAME，见下文）以防止其组分脂肪酸的氧化。
  
  图1. TLC在总脂质组分中的TLC分离。 kessleri
将构成的脂肪酸转化成脂肪酸甲酯
1. 取50μl花生酸溶液作为内标（IS，参见配方），用带有PTFE衬里的酚醛盖的玻璃螺旋盖试管（14ml vol。），在N 2 /天然气。
  注意：由于Chlorella kessrelli 11 h没有内源性C20系列脂肪酸，作者使用花生酸（C20：0）作为IS。十九烷酸（C19：0）也可以用作IS。
2. 将TAG和总脂质部分的5％刮下的硅胶分别放入试管中。后者的脂质溶液必须在N 2气流下风干。剩余的总脂质含量，即初始含量的50％，可以保存在-80°C以备以后分析。
3. 加入2.0ml的5-10％（w / v）氯化氢 - 甲醇试剂到每个试管中，密封，用涡旋混合器以最大速度搅拌30秒。
4. 将每个试管在95°C加热2小时，以使TAG脂肪酸或总脂质的甲基酯化。
5. 将管冷却至室温，并向其中加入2毫升正己烷。用涡旋混合器搅拌管子30秒，以最大速度提取FAME。
6. 立管1分钟，将其内容物分离成上层（正己烷）和下层（甲醇）层。
7. 通过玻璃巴斯德移液管将上层相转移到带有PTFE衬里的酚醛盖的玻璃螺旋盖离心管（50ml体积）中。
8. 加入2.0毫升正己烷到剩余的下层相中并涡旋30秒。
  在室温下将试管放置1分钟
9. 在步骤C7将上层的相回收到玻璃管中。
10. 重复步骤C8到C9两次，以强化提取FAME。
11. 用旋转蒸发器蒸发FAMEs溶液，并将干燥的样品溶解在少量（<50μl）正己烷中。将浓缩的FAMEs溶液转移到2毫升玻璃瓶中的0.15毫升插入物中，然后盖上4℃保存直至测量。
12. 用毛细管GLC分析样品的脂肪酸组成（见图2）。 GLC按照制造商的说明进行操作。 GLC的操作条件如表1所示。
  
  图2.来自C. kessleri的TAG的FAME的气相色谱图
  
  表1.用于测定脂肪酸组成的GLC操作条件
  
  注意：FID检测通过燃烧碳化合物而产生的离子（Holm，1999）。

数据分析

根据制造商的说明，用积分仪识别和计算色谱图上各个FAME的峰面积。与标准FAME混合物（Supelco 37组分FAME混合物，用正己烷稀释的100μg/ ml溶液）相比，FAME的鉴定基于保留时间。
检查色谱图是否与正在显示的适当基线正确集成
通过使用以下式[1]和花生酸（20：0）作为IS来定量每种FAME的分子种类。值160和312分别表示在步骤C1中得到的20:0（nmol）的含量和20:0的分子量。总脂质的摩尔含量可以基于包含的脂肪酸（式[2]）表示。
TAG含量估计为其构成脂肪酸总摩尔含量的1/3（式[3]）。请注意，获得的值与分析的各个样本中包含的值相对应。或者，基于脂肪酸估计TAG相对于总脂质的含量（式[4]）。如此处所示，根据用于TAG分析的总脂质比例（45％）与总脂质分析（5％）的比例，需要将“来自TAG的FAME的总含量”乘以1/9。定量结果应该用至少三次实验的平均值±标准偏差来表示。

注：FAME的峰面积由FA的分子量方便地分开，但是除FAME以外的FAME碳原子完全反应（Ackman和Sipos，1964）。

的食谱

1 / 4GB培养基，含或不含0.6M山梨糖醇
1. 将Gamborg的B5中等盐混合物（3.3g /包，表2）溶于蒸馏水中以制备正常的Gamborg's B5培养基（GB;最终体积，1L）
  
  表2. Gamborg B5中等盐混合物的化学组成
2. 添加750毫升的蒸馏水到250毫升的国标准备1/4 GB
3. 否则，将10g山梨糖醇溶于250ml GB中，同时加入蒸馏水以制备含有1 / 4GB（最终体积，1L）的0.6M山梨糖醇。
4. 含1 / 4GB的1/4 GB和0.6M山梨醇必须进行高压灭菌（120°C，20分钟）
花生酸溶液作为IS
1. 10毫克的花生四烯酸溶于10毫升的2-丙醇
2. 将溶液储存在2-8°C

的致谢

这项工作得到了东京药物和生命科学大学的支持。作者宣称不存在相互竞争的利益。

<强>参考

，R.G.和Sipos，J.C。（1964）。使用火焰离子化检测器在脂肪酸甲酯的气相色谱分析中应用特定的响应因子。 J Am Oil Chem Soc 41（5）：377-378。
Bligh，E.G。和Dyer，W.J。（1959）。一种快速的总脂质提取和纯化方法可将J Biochem Physiol 37（8）：911-917。
Dorschel，C.A。（2002）。通过电喷雾LC-MS-MS鉴定花生油的TAG。 J美国石油化学家协会（J American Oil Chemists'Society）79（8）：749-753。
Gamborg，O. L.，Miller，R.A。和Ojima，K。（1968）。大豆根细胞悬浮培养的营养需求 > Cell Res 50（1）：151-158。
Hayashi，T.，Otaki，R.，Hirai，K.，Tsuzuki，M.and Sato，N.（2017）。淡水绿藻中基于海水的三酰甘油积累的优化，<小球藻> >，通过同时施加低温和增强光强度。
Hirai，K.，Hayashi，T.，Hasegawa，Y.，Sato，A.，Tsuzuki，M.and Sato，N。（2016）。高渗及其与营养限制的结合是新型环境应激物，用于诱导三酰甘油在<小球藻。 Sci Rep 6：25825.
Holm T.（1999）。火焰离子化检测器机理的几个方面 842（1-2）：221-227。
MacDougall，K.M.，McNichol，J.，McGinn P.J.，O'Leary，S.J.B。和Melanson，J.E。（2011）。利用液相色谱 - 高分辨质谱对生物燃料原料的微藻菌株进行三酰甘油分析spectrometry。 Anal Bioanal Chem 401（8）：2609-2616。
McGowan，M. W.，Artiss，J. D.，Strandbergh，D. R.和Zak，B。（1983）。过氧化酶偶合法测定血清甘油三酯的比色法 Chem 29（3）：538-542。
Mendez，A.J.，Cabeza，C。和Hsia，S.L。（1986）。测定纳摩尔量的甘油三酯的荧光测定方法 Anal Biochem 156（2）：386-389。
Mu，H.，Sillen，H.和Hiy，C.E。（2000）。通过常压化学电离液相色谱法鉴定结构化脂质样品中的二酰甘油和三酰甘油/质谱法。 <美国石油化学家协会 77（10）：1049-1060。
Sato，N。和Tsuzuki，M。（2011）。叶绿体脂质的分离与鉴定 Methods Mol Biol 684：95-104。