材料和试剂

移液器吸头
15厘米培养皿
10毫升血清移液器
50毫升无菌锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
18号针
10毫升注射器
Falcon TM细胞过滤器，100μm（Corning，Falcon ，目录号：352360）
1.5 ml微量离心管
Greiner cellstar多壁培养板（24孔，Greiner Bio One International，目录号：662102）
细胞系：ID8卵巢癌细胞系（Yin等，2016）是Beth Israel Deaconess医学中心（美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）的Jack Lawler和Carmelo Nucera的礼物。
注：ID8细胞是来源于C57BL / 6背景的小鼠上皮OC系;通过注射前30和不到1周培养。
C57BL / 6小鼠，女性，年龄：8周
番茄报道基因转基因小鼠：通过稳定表达mCherry荧光蛋白标记ID8 OC细胞，而LysMCre小鼠与番茄报道分子mT / mG
杂交
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10567014）
D-葡萄糖
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
氯胺酮
牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：B14）
胶原酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17104019）
F4 / 80单克隆抗体，用于流式细胞术的APC缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：MF48005）
PE抗小鼠CD206（MMR）抗体（BioLegend，目录号：141705）
DAPI（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
抗小鼠E-钙黏着蛋白抗体（BD，Pharmingen TM，目录号：610404）
驴抗小鼠（Alexa面粉594）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-21203）
活细胞追踪器CMFDA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C2925）
EGFP（abm，目录号：LV011-a）
Na 2 HPO 4 4/2
NaCl
KH <2> PO <4>
KCl
康宁Matrigel（地下室膜基质，康宁，目录号：356234）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949-500ML）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：16005）
PBS（见食谱）
PBST（见食谱）
AC缓冲液（0.5％BSA）（见食谱）
2％Matrigel（见食谱）
3.7％多聚甲醛（见食谱）

设备

安全柜
移液助剂
用摆动转子离心机和适用于50-ml锥形管的适配器
水浴温度设定为37°C
加湿的细胞培养箱设置为37℃和5％CO 2
蔡司Axiovert 200荧光显微镜（卡尔蔡司，型号：Axiovert 200）
10倍物镜的直立显微镜
细胞分选仪和秤（BD，型号：FACSAria TM II）;按每小时80,000个细胞排序

软件

可以使用Openlab3软件（Improvision，Lexington，MA）或其他商业上可获得的图像分析软件来测量相邻细胞核的几何中心之间的平均距离的定量。
SAS软件（版本9.1.4，SAS Institute，Cary，NC）

程序

注意：所有动物研究均由耶鲁大学的动物管理和使用委员会批准。

巨噬细胞分离和标记
1. 用番茄报道分子C57BL / 6背景小鼠交叉溶菌酶Cre小鼠，并通过FACS分选从腹膜腔分离EGFP阳性巨噬细胞（Yin等人，2016）。
2. 作为球体的阳性对照，在100μlDMEM中将ID8细胞（1×10 6 / ml）注射到溶菌酶Cre C57BL / 6小鼠（年龄：8周）的腹腔中。根据耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的程序在9周后牺牲小鼠，并使用FACS分析和分选原发性小鼠肿瘤相关巨噬细胞（TAMs-GFP）（Yin等， 2016）。
ID8细胞培养物的制备
1. 在DMEM（4.5g / L D-葡萄糖，10％FBS，100IU青霉素和100μg/ ml链霉素）中展开ID8小鼠卵巢癌细胞（起始细胞数：1×10 6）置于15cm培养皿中培养ID8细胞直至达到70-80％汇合。
  1. 准备：准备一个安全柜。
    开机并让机柜在使用前达到工作气流压力约15分钟。
  2. 温暖的媒介。为了避免对细胞造成不必要的压力，在培养箱中平衡培养基。如果你要传代贴壁细胞，也要解冻并加热胰蛋白酶等分试样。
  3. 检查细胞：细胞应每天进行显微镜检查，以确保它们健康，并按预期增长。附着的细胞应该主要附着在培养皿的底部，圆形，丰满或拉长形状并在其膜周围折射光线。
2. 达到70-80％汇合后，从培养皿中吸出培养基并加入10ml新鲜DMEM。
3. 使用移液管辅助器和10毫升血清移液管通过用DMEM（10毫升）从培养皿中清洗它们来收获ID8细胞。
4. 将ID8细胞悬浮液从平板转移到50ml锥形管中，并通过以200μgxg离心4分钟（室温）来沉淀细胞。
5. 将ID8细胞悬浮在DMEM中并计数细胞并以1×10 6细胞/ ml的密度在DMEM中制备ID8的悬浮液，并将ID8细胞保存在冰上用于注射。
ID8肿瘤植入和转移模型
1. 无病原体的C57BL / 6背景小鼠购自THE JACKSON LABORATORY。
2. 将ID8细胞（在100μlDMEM中1×10 6 / ml）注射到C57BL / 6背景小鼠的腹腔内。
3. 每周测量小鼠体重增加量
4. 在出现明显的痛苦，痛苦或死亡迹象之前的九周，将处死小鼠
5. 测量腹水量和肿瘤重量，并通过组织学和FACS分析肿瘤球状体。
  在注射ID8细胞后8-10周内腹水可能开始积聚。当鼠标明显较大时，但在鼠标移动困难之前点击液体。用10号注射器连接的18号针小心取出尽可能多的液体。
  注意：镇静鼠标会使麻醉液的收集更容易：氯胺酮2 ng /鼠标。
从肿瘤球体收集TAMs（图3）

图3.从球体收集TAM的步骤
1. 使用Falcon™细胞过滤器从3毫升腹水中收集肿瘤球体。
2. 将肿瘤球体转移到50ml锥形离心管中，加入洗涤培养基（含有10ml PBS的0.5％BSA）2分钟并丢弃它，然后加入洗涤培养基，重复该洗涤步骤3次。
3. 在洗涤细胞结束时，将细胞悬浮液以200μgxg离心3分钟（室温）。
4. 丢弃洗涤介质，并在DMEM溶液中加入10ml 500U / ml胶原酶到含有肿瘤球体的管中。
5. 37°C孵育1小时，每15分钟剧烈搅拌一次。在孵化期结束时，球体应该几乎完全消化，不再可见。
  注意：如果球体在1小时后仍然可见，则继续培养，每15分钟检查一次，直到球体不再可见（不超过2.5小时）。
6. 在胶原酶消化结束时，将细胞悬浮液在200×g下离心10分钟（室温）。
7. 。小心取出管中的上清液，不要将颗粒移出。
8. 加入2ml FACS缓冲液（含PBS的0.5％BSA）到50ml管中并悬浮细胞沉淀，然后通过过滤器将悬浮液转移到FACS管中（Corning Falcon 5ml带细胞滤网咬合盖的圆底管，A35 μm尼龙网）。
  注意：有必要获得单细胞悬液。
9. 再次将细胞悬液以200×g离心10分钟（室温）。
10. 。小心取出管中的上清液，不要将颗粒移出。
11. 在500μlFACS缓冲液中重悬沉淀
12. 加入2.5μlF4 / 80（APC，0.2mg / ml）和5μlCD206（PE，0.2mg / ml）抗体染色TAMs。
13. 通过FACS分析（图2）分类GFP <+> F4 / 80 <+>和 + <+> TAM。
图2. M2TAMs的FACS分选从携带卵巢癌的供体小鼠收集球状体并分散到单细胞中。通过在FACSAriaII（BD Biosciences）上进行FACS分选来分离用抗-F4 / 80和抗-CD206标记的细胞。
带Matrigel的预涂24孔板
检查3D培养模型以确定适合我们研究的细胞培养系统。
1. 在基于3D的模型中，通过将160μlMatrigel添加到每个孔中，用Matrigel作为基底膜预涂24孔板。
2. 在37°C孵育30分钟以使Matrigel凝固。
3. 将细胞（来自步骤D7，ID8细胞或SKOV-3的TAM）在含有2％Matrigel（3D-碱基和嵌入的，含有层粘连蛋白作为主要的）的1ml常规培养基中铺板到凝胶上组分，IV型胶原蛋白，硫酸肝素蛋白聚糖，entactin和其他次要成分）。
TAM和ID8细胞的3D共培养系统
1. 通过FACS从含有卵巢癌的供体番茄lysM-1的球状体中分选分离小鼠GFP + F4 / 80 +和CD206 + TAM。 cre 老鼠。
2. 如上所述，预涂24孔板用基质胶预包被。
3. 将TAM和ID8细胞的混合物（比例为1:10，但具有固定的总细胞数量为40,000个细胞/孔）直接接种到每孔中含有300μlDMEM的Matrigel预包被的24孔板上。 >
4. 培养细胞在37°C孵育48小时，以形成聚集体球状体。
  注：不含细胞但含有培养基的孔用作阴性对照。
通过免疫荧光方法在ID8细胞中进行E-钙粘蛋白染色
1. 每次用500μlPBS轻轻冲洗孔2次以除去DMEM。
2. 去除PBS后，加入300μl缓冲的多聚甲醛（3.7％多聚甲醛，10nM，pH7.4）10分钟。
3. 用PBS清洗孔2次，除去PFA，加入100μlE-钙粘蛋白抗体（1：200含1％BSA）在4℃过夜孵育（染色方案参见Yin等人，2016）。
4. 第二天用500μlPBST将球状体洗3次，时间约为15分钟。
5. 将具有球状体的24孔板加100μlPE抗小鼠第二抗体（1：500与1％BSA）并在室温孵育1小时。
6. 在Zeiss Axiovert 200荧光显微镜（Carl Zeiss MicroImaging; Thornwood，NY）下使用Openlab 3软件（Improvision，Lexington，MA）捕获荧光显微图像。捕获的图像用于分析细胞形态。

数据分析

在荧光显微镜下直接观察球状体或使其经历Line对抗CD68，抗K14和DAPI进行免疫染色，随后进行共焦成像（见图1）。
对48小时的球体的数量（每个孔）和大小（面积）进行量化。
统计分析：通过学生的测试分析球体形成结果的差异。本研究中的统计分析使用SAS软件（版本9.1.4，SAS Institute，Cary，NC）进行。所有统计学检验均为双尾检验，<0.05> <0.05为差异有统计学意义。所有数据均以平均值±SEM表示，n = 5，*， 0.05; **， P 0.01; ***， P ＆lt; 0.001。

笔记

对于基质胶的制备，将移液器吸头冷冻以更好地处理Matrigel（应该在4°C下使用）。
或者，分离来自C57BL / 6背景小鼠的小鼠腹膜巨噬细胞，随后用活细胞追踪器CMFDA（Qin等人，2014）或通过用表达EGFP的慢病毒转导进行预染色，如我们已经表明的通过FACS分选检测血管内皮细胞（Zhou等人，2016）。
安乐死：小鼠安乐死过量≥100毫克/千克体重戊巴比妥，并放血。
SKOV3人卵巢癌细胞:(人卵巢腺癌细胞系）获自ATCC。 SKOV3细胞对肿瘤坏死因子和几种细胞毒性药物，包括白喉毒素，顺铂和阿霉素都有抗性。

食谱

PBS
8mM Na 2 HPO 4 4/2 136 mM NaCl
2mM KH 2 PO 4 4/2 2.6 mM KCl
PBST

500毫升1x PBS 1毫升Tween-20
AC缓冲液（0.5％BSA）

加入50毫克BSA到10毫升PBS中
常规媒体

加入50 ml胎牛血清和5 ml青霉素和链霉素到500 ml DMEM培养基中
2％Matrigel

加入200μlMatrigel到10 ml常规培养基中注：2％Matrigel含8-12mg / ml蛋白质，其中包括层粘连蛋白（主要成分），IV型胶原蛋白，硫酸肝素蛋白多糖，entactin和其他次要成分。向凝胶中添加IV型胶原增加了聚合。
3.7％多聚甲醛
加入37毫克多聚甲醛到1毫升PBS中

致谢

利益冲突披露：无。
这项工作得到了WM，R01 HL109420和R01 HL115148的部分支持，中国国家重点科学研究计划（2016YFC1300600），国家自然科学基金（编号91539110）和广东科学基金（编号2015B020225002和2015A050502018）和西格玛干细胞创新奖（建立研究者资助）14-SCB-YALE-17。

参考

Jemal，A.，Siegel，R.，Ward，E.，Hao，Y.，Xu，J。和Thun，M.J。（2009）。 2009年癌症统计数据 Cancer J Clin 59 （4）：225-249。
Peart，T.，Ramos Valdes，Y.，Correa，RJ，Fazio，E.，Bertrand，M.，McGee，J.，Prefontaine，M.，Sugimoto，A.，DiMattia，GE和Shepherd，TG（2015）。完整的LKB1活性是休眠卵巢癌球状体生存所必需的。 Oncotarget 6（26）：22424-22438。
Qin，L.，Huang，Q.，Zhang，H.，Liu，R.，Tellides，G.，Min，W.和Yu，L。（2014）。 SOCS1通过保护内皮细胞功能防止移植动脉硬化 J Am Coll Cardiol 63（1）：21-29。
Rafehi，S.，Ramos Valdes，Y.，Bertrand，M.，McGee，J.，Prefontaine，M.，Sugimoto，A.，DiMattia，G.E。和Shepherd，T.G。（2016）。 TGFβ信号调节卵巢癌腹水衍生球体的上皮 - 间充质可塑性 Endocr Relat Cancer 23（3）：147-159。
Siegel，R.，Naishadham，D.和Jemal，A。（2012）。 2012年癌症统计数据 CA Cancer J Clin 62 （1）：10-29。
Tan，D.S.，Agarwal，R.和Kaye，S.B。（2006）。卵巢癌转移瘤的转移机制 Lancet Oncol 7（11）：925-934。
中国科学院上海生命科学研究院生物化学与分子生物学研究所研究人员发现， W.（2016）。肿瘤相关巨噬细胞驱动卵巢癌早期transcoelomic转移过程中的球体形成 J Clin Invest 126（11）：4157-4173。
Zhou，HJ，Qin，L.，Zhang，H.，Tang，W.，Ji，W.，He，Y.，Liang，X.，Wang，Z.，Yuan，Q.，Vortmeyer，A.，Toomre ，D.，Fuh，G.，Yan，M.，Kluger，MS，Wu，D。和Min，W。（2016）。 CCM3缺陷引起的血管生成素-2的内皮细胞胞吐作用有助于大脑海绵状血管畸形的进展。 Nat Med 22（9）：1033-42。