材料和试剂

移液器吸头
50ml无菌圆锥形Falcon管（EZ Flip TM，Thermo Fisher Scientific，目录号：362696）。
1.5 ml无菌Eppendorf离心管（Eppendorf，目录号：022364111）
声波处理设备
注意：这是在我们的实验室中通过将四个塑料管（直径3厘米，高3厘米）连接到塑料盒（图1）来组装的。

图1.超声处理设备
纸巾（WypAll * X 60 Jumbo Roll，KCWW，Kimberly-Clark，目录号：30218593）
刮刀
Pyrex托盘（Pyrex®储存13 x 18厘米）
P上。绿脓杆菌菌株
注：PAO1，被称为野生型，过氧化氢酶突变体PW8190和PW8769获自华盛顿基因组中心。通过将IslacZ / hah转座子插入katA（PW8190，下文中为无KatA的菌株）或katB（PW8769，下文中为KatB无菌株）（Jacobs等，2003）来构建过氧化氢酶突变体。
蒸馏水
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Merck，目录号：103753）
氯化钠（NaCl）（Biopack，目录号：1646.08）
来自牛血清的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A4378）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
过氧化氢（H 2 O 2）30％（Merck，目录号：107210）
Bugbuster蛋白提取试剂（Merck，Novagen，目录号：70584-4）
硫代硫酸钠（Na 2 S 2 O 3）（Avantor Performance Materials，Macron TM，目录号：8100 -04）
过硫酸铵（（NH 4）2 S 2 O 8）（MP Biomedicals，目录号：04802811）
TEMED（MP Biomedicals，目录号：02195516）
Trizma碱（Tris [羟甲基]氨基甲烷）（C 4 H 11 NO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503） />
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
盐酸发烟37％（HCl）（Merck，目录号：100317）
丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A8887）
双丙烯酰胺N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：M7256）
EDTA（Merck，Calbiochem，目录号：324503）
氢氧化钠（NaOH）（Avantor Performance Materials，Macron TM，目录号：7708）
甘油（Merck，目录号：104094）
溴酚蓝（VWR，DBH，目录号：20015）
氯化铁（FeCl 3）（Avantor Performance Materials，Macron TM，目录号：5029-04）
铁氰化钾（K 3 Fe（CN）6）（UCB，目录号：b1599）
LB培养基（见食谱）
4 M NaCl（见食谱）
盐溶液（见食谱）
50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7（见食谱）
30 mM H 2 O 2（见食谱）
4 mM H 2 O 2（见食谱）
10％过硫酸铵（见食谱）
1.5M Tris-HCl缓冲液pH8.8（参见食谱）
1.5 M Tris-HCl缓冲液pH 6.8（见食谱）
30％丙烯酰胺混合溶液（丙烯酰胺双丙烯酰胺比例37.5:1）（见食谱）
6％分解凝胶溶液（见食谱）
5％浓缩凝胶溶液（请参阅食谱）
1M Tris-HCl缓冲液pH 8（见食谱）
0.5 M EDTA pH 8（见食谱）
加载样品缓冲液（见食谱）
运行缓冲区（请参阅食谱）
三氯化铁/铁氰化钾溶液（见配方）

设备

50，125和150ml无菌锥形瓶（DWK Life Sciences，Duran，目录号：21 216 17,21216 28,2199027）。
2-20μl，20-100μl，100-1,000μlKartell pluripet微量移液管（Kartell LABWARE，目录号：13000,13210,13220）和1-10ml Acura手动微量移液管（Socorex，型号：讴歌手册825 /讴歌手册835）
50,100和1000毫升硼硅酸盐量筒（VILABO，产品目录号：3501114,3501115,3501118）
常规培养摇床（New Brunswick Scientific，型号：G25）
旋转式水浴摇床（New Brunswick Scientific，型号：G76）
制冰机（Brema，型号：TB 551）
紫外可见分光光度计（Biotraza，型号：752）
冷冻离心机（Hanil Scientific，型号：Combi 514R）
Vibra-Cell超声仪（Sonics＆amp; Materials，型号：VC500）
电泳细胞（Bioamerica，型号：DYCZ-24DNBA）
电源（Bioamerica，型号：DYY-6CBA）
冷冻超低温（三洋，型号：MDF-U76VC）
高压灭菌器（HIRAYAMA，HICLAVETM，型号：HVE-50）
热风烘箱灭菌器（Dalvo Intrumentos，型号：OHR / T）

程序

细胞提取物的制备
非诱导条件
1. 在30ml LB培养基中于150ml锥形瓶中在37℃振荡（200rpm）下培养绿脓假单胞菌菌株（PAO1，KatA-少和KatB-少）过夜。
2. 将培养物（20ml）在50ml Falcon管中离心10分钟，10000×g，4℃。丢弃上清液。
3. 用20毫升冷盐水溶液重悬细胞并将其保存在冰上。
4. 离心10分钟，10000×g，4℃。丢弃上清液。
5. 将细胞重新悬浮于冰冷的50mM磷酸钠缓冲液（pH7）中直至OD6501（约7ml）。
6. 在下列条件下，在冰水浴中（图1），在塑料管中超声处理5 ml浓缩细胞：脉冲模式下2 min，尖端直径18 mm，占空比50％，微尖端限制2.将样品保存在冰上。
7. 将提取物离心10分钟，10000×g，4℃。丢弃携带未分离细胞和细胞碎片的小球。将上清液保存在冰上数小时，直至使用或储存在-80°C。
8. 根据Lowry等人（1951）确定提取物的蛋白质浓度;使用牛血清白蛋白作为标准。
诱发条件
1. 在30ml LB培养基中于150ml锥形瓶中在37℃振荡（200rpm）下培养铜绿假单胞菌菌株（PAO1和KatB-less）过夜。
2. 在125ml锥形瓶中的30ml新鲜LB培养基中将过夜培养物稀释至OD505.01，并在37℃的旋转式水浴振荡器中生长，直到培养物达到OD650 / sub> 0.3。这个OD在2小时内达到。
3. 将培养物在50ml锥形瓶中分成两份，每份10ml。保持其中一个未处理（对照），并在无菌条件下每10分钟将2.26μl的30mM H 2 O 2 2加入另一部分1小时，同时摇动两者在37℃下的分数。
4. 在1小时结束时取5ml处理的培养物并加入10μl1mg / ml硫代硫酸钠以中和H 2 O 2 2的作用;没有必要将样品放在冰上。
5. 将中和的培养物和5ml对照培养物离心10分钟，10000×g，4℃。丢弃上清液。
6. 用10毫升冰冷的50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）重悬细胞。
7. 离心10分钟，10000×g，4℃。丢弃上清液。
8. 将细胞重悬于1毫升BugBuster蛋白提取试剂中，并在室温下保持15分钟。
9. 离心10分钟，16,000×g，4℃。将上清液保存在冰上数小时，直至使用或储存在-80°C。
10. 根据Lowry等人（1951）确定提取物的蛋白质浓度;使用牛血清白蛋白作为标准。＆nbsp;
图2描述了诱导条件的协议。
注意：
1. 抗生素不添加到培养基中。
2. 使用BugBuster Protein Extraction Reagent代替超声处理来检测KatB活性。该试剂能够穿透细胞壁而不会使可溶性蛋白质变性。它提供了一种机械方法的替代方法，例如French Press或用于释放蛋白质的超声处理。
图2.实验程序原理图
PAGE
1. 将两块玻璃板放在凝胶浇铸台上，使用特殊的楔形框架（见图3）。
  
  图3.电泳细胞（Bioamerica）
2. 吸取6％分辨凝胶溶液到玻璃板之间的缝隙中。
3. 等待15-30分钟，直到它凝固。
4. 吸取5％浓缩胶溶液直至溢出。
5. 插入梳子，不要将空气留在牙齿下面。等待15-30分钟，直到它凝固。
6. 将玻璃板从凝胶浇铸架中取出并放入电泳池中。
7. 将运行缓冲液倒入电泳池中，直到缓冲液水平高于（较短的）内部凝胶板的顶部（即
8. 将50μl细胞提取物与2μl上样缓冲液在1.5ml Eppendorf管中混合，并在沸水中加热10分钟。
9. 每个样品加入10μg蛋白质到每个孔中。
  使用盖子覆盖电池并将电极连接到电源。
10. 在室温（非诱导条件，KatA活性）或4°C（诱导条件，KatB活性）下以15mA运行电泳。
  注意：电泳在4°C运行以检测KatB活性。这可以在冷室或冰箱中完成。但是，这对检测KatA活动不是必需的。
11. 当染料前沿几乎达到玻璃板的底部时停止PAGE运行。运行一般需要4小时。
凝胶发展
1. 从电泳槽中取出玻璃板并放在纸巾上。使用抹刀分开盘子。
2. 在室温下将凝胶浸入Pyrex托盘中的蒸馏水中5分钟。丢弃水。
3. 在室温下用100ml含有4mM H 2 O 2的溶液孵育凝胶10分钟。
4. 去除溶液并在室温下用100ml蒸馏水洗涤凝胶。
5. 在室温下将凝胶浸泡在含有1％（w / v）氯化铁和1％（w / v）铁氰化钾的100ml溶液中。
6. 凝胶变成深绿色后，取出三氯化铁/铁氰化钾溶液并用蒸馏水冲洗以防止过度发展。
7. 一旦染料被去除，立即拍摄凝胶。在4°C下在蒸馏水中储存几天是可能的。过氧化氢酶活性区域显示为清晰的条带。
注意：在洗涤和染色步骤中不需要使用振荡器或章动器。

数据分析

根据上述的这个程序，图4显示了使用非诱导条件（A）或用H 2 O 2 2诱导条件对过氧化氢酶活性染色的非变性聚丙烯酰胺凝胶的代表性图像。（B）。

图4. p。的过氧化氢酶非天然PAGE分析。绿脓杆菌野生型（PAO1）及其衍生物KatA-less和KatB-less菌株A.在非诱导下生长的PAO1（野生型），KatA-less和KatB-less菌株的提取物条件。检测到的唯一活动与KatA相对应，因为在此情况下不会表示KatB。 B.分析未处理（ - ）或用亚致死浓度H 2 O 2（+）处理的PAO1和KatB-少的菌株的培养物的过氧化氢酶活性，以证明检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的KatB活性。
注：图像最初是在Pezzoni等人（2014年）中报道的。细胞外过氧化氢酶（KatA）对铜绿假单胞菌生物膜中UVA辐射的保护作用。 J Photochem Photobiol B：Biol 131,53-64。

食谱

LB媒介
解散：
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
5克NaCl

在蒸馏水中容量达1000毫升在1个大气压下高压灭菌20分钟
4 M NaCl

溶解200毫升蒸馏水中的46.7克氯化钠在1个大气压下高压灭菌20分钟
盐水溶液

将7.5 ml无菌4 M NaCl与300 ml无菌蒸馏水混合
50mM磷酸钠缓冲液，pH 7
溶液A：将70.99克Na 2 HPO 4溶于500毫升蒸馏水中
溶液B：在500毫升蒸馏水中溶解59.98克NaH 2 PO 4。
将10.6ml溶液A与14.4ml溶液B混合并加入475ml蒸馏水。
30mM H 2 O 2：n / 2 向100ml 50mM磷酸钠缓冲液（pH 7）中加入0.340ml 30％H 2 O 2。准备新鲜的每个活动分析

在实验过程中，溶液可以保持在室温
4mM H 2 O 2：2 向100ml蒸馏水中加入0.045ml 30％H 2 O 2：
准备新鲜的每个活动分析
10％过硫酸铵
将1克过硫酸铵溶于10毫升蒸馏水中
存放在-20°C（保质期3个月）
1.5M Tris-HCl缓冲液pH8.8
将18.5克Trizma碱溶解在80毫升蒸馏水中
用浓盐酸调节至pH8.8，并将体积补足至100ml
1M Tris-HCl缓冲液pH 6.8
将12.114克Trizma碱溶于80毫升蒸馏水中
用浓盐酸调节pH至6.8，并将体积调至100ml
30％丙烯酰胺混合溶液
将60克丙烯酰胺和1.6克双丙烯酰胺溶于200毫升蒸馏水中（丙烯酰胺双丙烯酰胺比例为37.5:1）

注意：

避免与聚丙烯酰胺，铁氰化物和凝胶直接接触;他们需要小心处理。
在溶解和堆积凝胶溶液中添加溶液的顺序非常重要，可以避免在将玻璃板倒入玻璃板之前进行早期聚合。

6％分解凝胶溶液

5％浓缩胶溶液
2.1毫升蒸馏水

0.5毫升30％丙烯酰胺混合物 0.38 ml 1.5 M Tris（pH 6.8）

0.03毫升10％过硫酸铵 0.003毫升TEMED
1M Tris-HCl缓冲液pH 8
将12.114克Trizma碱溶于80毫升蒸馏水中
用浓盐酸调节pH至8，并将体积调至100 ml
0.5 M EDTA pH 8

溶解在200毫升蒸馏水中的47克EDTA
用浓NaOH调节至pH 8，并将体积补充至250 ml
加载样本缓冲区
1毫升1M Tris-HCl（pH 8）
4毫升0.5M EDTA（pH8）
4毫升甘油
25毫克溴酚蓝
1毫升蒸馏水
在-20°C储存
运行缓冲区

在3.0毫升蒸馏水中溶解3.03克Trizma碱和14.4克甘氨酸在4°C储存（保质期3个月）
三氯化铁/铁氰化钾溶液

1克三氯化铁和1克铁氰化钾溶于100毫升蒸馏水中准备新鲜的每个活动分析

致谢

感谢P. Pereyra Schuth女士的出色技术支持。该协议基于Wayne和Díaz（1986）的工作。该研究的经济支持来自阿根廷国家能源委员会（阿根廷）。熔点是Consejo Nacional de InvestigacionesCientíficasyTécnicas（CONICET，阿根廷）的调查员。作者声明没有利益冲突。

参考

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