材料和试剂

用于感兴趣的RNA的转录的线性化DNA模板
（Applied Biosciences，目录号：AM1308M）（此试剂盒含有ATP，CTP，GTP，α-P32UTP和DNase I）。
RNasin（Promega Corporation，目录号：N2611）
RNase T1（Applied Biosciences，目录号：10109193001）
0.5 M EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15575-038）
ddH 2 O（GeneMate Loyalty，目录号：UPW-1000）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M-2393）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7893-1L）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D9779-5G）
Tris-Base（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L-4390）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
TEMED
二氨基硫酸盐
5x绑定缓冲区（参见配方）
2x SDS加样缓冲液（见配方）
10x TGE缓冲区（参见配方）
6％TGE凝胶（见配方）

设备

SPIN-PureTM柱（G-50）（PireBiotech SCW50-50DEPC-水）
SDS-PAGE系统（Bio-Rad，目录号：165-1802）
UV Stratalinker 1800（Stratagene，目录号：474645）
电影处理器（Konica Minolta，型号：SRX-101A）
离心机（Eppendorf，目录号：5810R）
闪烁计数器（Beckman，目录号：LS6500）
带6-1/4"底座的台式辐射屏蔽（Cole-Parmer，目录号：WU-36218-00）
37°C水浴

程序

32转录的RNA标记物的体外转录
1. 用于合成RNA探针的DNA模板通过使用特异性引物的PCR产生
2. 解冻冷冻的试剂，将RNA聚合酶置于冰上，并涡旋10x转录缓冲液，并将缓冲液保持在室温。所有试剂应在开启前短暂离心
3. 在室温下按如下顺序组装转录反应：
  1μgDNA模板
  ddH 2 2至20μl
  2μl10×转录缓冲液（加入水和DNA后）
  1μl10 mM ATP
  1μl10 mM CTP
  1μl10 mM GTP
  5μl[α-³² P] UTP
  2μlT7酶混合物
  2μlRNasin（40U /μl）
  彻底混合。
4. 在37℃孵育1小时。
5. 加入1微升5毫克/毫升DNase I消化其余模板DNA，并在37℃水浴中孵育10分钟。
6. 加入1μl0.5M EDTA，混合并加入78μlddH 2 O以将终体积调整至100μl并混合。
用SPIN-Pure柱（G-50）纯化32P-标记的RNA探针，
1. 在进行以下步骤之前，至少等待30分钟的室温对色谱柱进行加温。
2. 轻轻倒置几次柱子以悬浮柱缓冲液（DEPC-Water）。
3. 从柱中取出顶盖，然后取下底部端
4. 在继续之前，允许柱缓冲液通过重力排出。
5. 将此柱/管装置放入适配器管中。在室温下以1,100×g离心2分钟。
6. 再次重复离心使柱子完全干燥，弃去收集管和洗脱缓冲液
7. 将柱置于直立的第二个收集管中，非常缓慢和仔细地将RNA样品（20至50μl）应用于柱凝胶的中心（其余的RNA样品可以储存在-80° C一个星期）。
8. 以1,100×g离心4分钟。将纯化的32 P标记的RNA探针收集在收集管的底部。丢弃旋转柱并继续以下过程。
9. 选择1μlRNA样品并计数cpm值。
RNA和蛋白结合反应
1. 在冰上制备以下混合物：
  32-标记的RNA探针（2×10 5次/cpm）
  1μl12.5 mM ATP
  3μl5×结合缓冲液
  3μl0.5M KCl
  蛋白（100ng）（该蛋白可以是根据GE Healthcare Life Sciences制备的方案纯化的GST融合蛋白）
  H 2 O至最终体积为15μl
2. 通过上下吹打10次轻轻混匀，避免涡旋
3. 将含有反应混合物的未覆盖管置于冰上，直接在254-nm UV光源的灯泡下方（距离表面约10cm），用4×10 5μJ/cm 2 > 2 能量。
4. 在室温下孵育30分钟，然后在冰上再保持3小时
删除未并入的³² P
1. 加入1微升的核糖核酸酶T1（1 U /微升）到每个管，在37℃下孵育另外10分钟，以降解游离RNA。
2. 加入等体积（16μl）2x SDS上样染料，并将样品在TGE凝胶或SDS-PAGE（无需煮沸）中分离。
3. 放射自显影12小时至7天可视化。

食谱

5x结合缓冲液
50mM HEPES（pH 7.2）
15mM MgCl 2·h/v 25％甘油 5 mM DTT
储存于-20°C
2x SDS上样缓冲液
125mM Tris-Cl（pH7.6） 20％（v/v）甘油 4％（w/v）SDS
0.008％（w/v）溴酚蓝
20 mM DTT
10x TGE缓冲区
Tris 100mM
甘氨酸1 mM / EDTA 10mM
pH 8.3
6％TGE凝胶
6ml 30％丙烯酰胺 5 ml 10x TGE缓冲液
35ml H 2 O 2 / 300μl氨基硫酸盐
22μlTEMED
注意：
1. 避免RNA酶污染是成功的关键。
2. 因为³² P是放射性的，所以该实验应在保护台式辐射屏蔽下进行。

致谢

这项工作由国家卫生研究院（R01 CA123490和R01CA143107到MZ）和CURE（MZ和LG）支持。

参考文献

Gu，L.，Zhang，H.，He，J.，Li，J.，Huang，M.and Zhou，M.（2012）。 MDM2调节MYCN mRNA在人神经母细胞瘤细胞中的稳定和翻译。癌基因 31（11）：1342-1353。
Walker，J.，de Melo Neto，O.and Standart，N。（1998）。凝胶阻滞和紫外线交联试验检测特异性RNA-蛋白相互作用的5'或3' UTRs of translationally regulated mRNAs。 Methods Mol Biol 77：365-378。