材料和试剂

1.5毫升Eppendorf管（Eppendorf ®）
钢珠（直径：3.175 mm）
营养土壤
蛭石
移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-1000-B; T-200-Y; T-300）
新鲜采摘的 Adiantum capillus-veneris的羽片
注意：该植物在北京大学的栽培室培养了几年，并使其成为驯化。
液氮
β-巯基乙醇（BME）（赛默飞世尔科技，Gibco ®，目录号：21985023）
PVP-40（AMRESCO，目录号：0507-500G）
苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（Coolaber，目录号：SL2040-100ML）（纯度：AR）
氯仿，纯度：AR
异丙醇，纯度：AR
75％乙醇，纯度：AR
超纯水
CTAB（AMRESCO，目录号：0833-1KG）
氯化钠，纯度：GR
EDTA（AMRESCO，目录号：0322）
Tris（AMRESCO，目录号：0497-5KG）
RNase I
HCl，纯度：AR
M3（Marker III）（TIANGEN Biotech，目录号：MD103）
2％CTAB（见食谱）
10％RNaseI（TaKaRa，目录号：2158-1）（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf ®）
不锈钢勺子＆nbsp;
砂浆（直径：100毫米）和杵（尺寸：117毫米）
组织研磨机（Retsch ®，TissueLyser II）
水浴（65°C）
高速离心机（不需要制冷）
冰箱（-20°C）
烤箱（37°C）
电磁搅拌器
电泳设备

程序

样品制备
在这里，我们描述了两种样品制备方法：一种是液氮法，另一种是钢珠法。它们都需要植物在适当条件下生长的羽片。此外，样品量也是一个关键因素。钢珠法适用于高通量gDNA提取。
注意：
1. 耳廓的条件对于gDNA产率是至关重要的。该方法需要来自在适当环境下生长的植物的Pinnae（温度：25°C，湿度：65％，16小时白光和8小时黑暗处理;土壤条件不是该方案中的关键因素。参考，我们通常将营养土与蛭石（约10：1）混合作为培养基。
2. 避免使用过多样品进行gDNA分离。样品量对性能至关重要。对于500μlCTAB溶液，建议使用10-20 mg耳廓。图1提供了不同阶段的耳廓参考尺寸。
  
  图1. Ac pinnae的不同阶段显示可用于gDNA提取的样本。 A-B。少年羽片;光盘。带有绿色和早熟孢子囊的羽片; E-F。羽片有棕色和成熟的孢子囊; G. Pinna与开裂的孢子囊。＆nbsp;
液氮法
1. 用液氮冷却不锈钢勺，研钵和研杵。＆nbsp;
2. 收获2-3个新鲜采摘的羽片（总湿重：10-20mg），并使用彻底冷却的研钵和研杵在液氮中研磨成细粉。然后将粉末转移到管中。
  注意：在此过程中，所有设备应在液氮中充分冷却。在研磨时注意不要让液氮干燥，并且在用CTAB溶液萃取之前，研磨的组织必须保持冷冻。意外解冻可能导致DNA降解。
3. 向管中加入500μl2％CTAB溶液（参见配方）。通过轻弹管底部混合，直到样品完全悬浮。
  注意：确保在2％CTAB溶液中加入BME和PVP，最终浓度为2％BME和0.2％PVP。
钢珠方法
1. 在新的干净管中加入2-3个钢珠。将500μl2％CTAB溶液（参见配方）加入管中。
  注意：确保在2％CTAB溶液中加入BME和PVP，最终浓度为2％BME和0.2％PVP。
2. 收获2-3个新鲜采摘的羽片（总质量：10-20mg）并转移到管中。在室温下（25.0hz，5分钟）用组织研磨机研磨材料。
3. 短暂离心3-5秒以避免样品粘在管盖上。让我们在65°C水浴中静置10分钟，使组织软化，使其更容易破裂。在室温下冷却约2分钟。
4. 用组织研磨机再次研磨材料（25.0hz，10分钟）。看看耳廓是否完全研磨。如果是，则继续执行以下步骤。如果没有，重复步骤3和4.研磨前后的样品如图2所示。
  
  图2.研磨前的材料（之前）和完全研磨的材料（之后）
DNA提取
1. 将CTAB处理的样品短暂离心3-5秒。在65°C水浴中孵育1小时。在水浴中孵育期间，通过将管倒置3-4次进行混合。取出样品，在室温下冷却1分钟。
  注意：样品可以在冰上或室温下冷却。您可以在准备试剂和材料时进行冷却步骤，此步骤无需加冰。
2. 向管中加入500μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）。剧烈摇晃，彻底搅拌。将样品在12,000 x g 下离心15分钟。
3. 用移液管将上清液转移到新的干净管中。注意不要在中间层转移白色蛋白质。
4. 向水相中加入等体积的氯仿。通过摇动和翻转混合。将样品在12,000 x g 下离心15分钟。
5. 用移液管将上清液转移到新的干净管中。注意不要在中间层转移白色蛋白质。
6. 向水相中加入等体积的异丙醇。轻轻倒转管混合，让其在-20°C下静置至少1小时。将样品在12,000 x g 下离心15分钟。
7. 倒出上清液，小心不要丢失颗粒。
  注意：可能很难看到颗粒。
8. 向管中加入700μl75％乙醇。
9. 将样品在12,000 x g 下离心5分钟。小心地倒出上清液。短暂离心3-5秒以收集残余液体并用移液管将其除去。打开管盖，水平放置，静置过夜，使颗粒风干。
10. 向管中加入30μl超纯水或TE，静置10分钟以溶解gDNA样品。
  注意：将样品溶解在超纯水中，用于后续的DNA测序。对于长期长期储存，将样品溶解在30μlTE中。
11. 向管中加入1μl10％RNaseI，在37℃下孵育1小时。
12. 将gDNA样品保存在-20°C。

数据分析

凝胶电泳的结果如图3所示。当耳廓的量过多时，所有gDNA样品都显示出高降解率（图3A）。当我们减少材料量时，降解速率显着降低（图3B）。然而，如果我们从在不适合的环境中培养的蕨类植物中提取材料，结果仍显示出不稳定的降解速率。在合适的环境中从植物中采摘材料可以解决这个问题。

图3.从不同量或生长条件的材料中提取的gDNA样品的凝胶电泳。：一种。从过量的材料中提取的gDNA样品（每种约60mg）。 B.从中等量的物质（每种10-20mg）中提取的gDNA样品。适宜的栽培环境：温度：25°C，湿度：65％，16小时白光和8小时黑暗处理。不适宜的栽培环境：温度：20°C，湿度：21％（自然阳光处理：约12小时光照和12小时黑暗）时间：24小时。

食谱

2％CTAB溶液（400毫升）

CTAB
8克

氯化钠
8克

0.5 M EDTA
16毫升

1.0 M Tris-HCl（pH 7.5）
40毫升

PVP-40
0.8克

ddH 2 O to
400毫升

与磁力搅拌器混合过夜
使用前立即加入8毫升BME
10％RNase I（10μl）

RNase I
1μl

超纯水
9μl

致谢

该方案根据Han et al。。，（2012）中公布的程序进行了优化。我们感谢中国农业科学院蔬菜和花卉研究所为 Adiantum 栽培提供温室。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考
1. Han，J。D.，Qin，M。和Wang，X。（2012）。不同DNA提取方案的比较 Adiantum capillus-veneris L. J河南农业大学 02：70-75。（用中文（表达）
2. Li，X.，Han，J.D.，Fang，Y.H.，Bai，S.N。和Rao，G.Y。（2017）。 Adiantum capillus-veneris 体细胞胚胎发生过程中胚胎发生相关基因的表达分析> L. 体外：对陆地植物生殖器官进化的新见解。 Front Plant Sci 8：658。
3. Ponnusamy，Y.，Chear，N.J.，Ramanathan，S。和Lai，C。S.（2015）。 Dicranopteris linearis 富含多酚的部分促进成纤维细胞迁移和增殖体外。 J Ethnopharmacol 168：305-314。