材料和试剂

移液器吸头
玻璃瓶50 x 14 mm，带塑料srew瓶盖5 ml（schuett-biotec，目录号：3563143）
Eppendorf安全锁管（Eppendorf，目录号：022363352）
15毫升管PP（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
Pico Prias Vial 6 ml（PerkinElmer，目录号：6000193）
Parafilm（IDL，目录号：2801310131）
Omnifix-F Syringes 1 ml（B. Braun Medical，目录号：9161406V）
动物饲养针（精细科学工具，目录号：18061-20）
100 Sterican Hypodermic needle（B. Braun Medical，目录号：4657519）
C57BL / 6小鼠（查尔斯河）
Intralipid ® 20％（Baxter，目录号：2B6064）
甲醇（Carl Roth，ROTISOLV ®，目录号：7583.1）
氯仿（Carl Roth，ROTISOLV ®，目录号：4432.1）
NaCl 0.9％（B.Braun Medical，目录号：817403）
胆固醇，[4- 14 C] - ，50μCi（1.85 MBq）（PerkinElmer，目录号：NEC018050UC）
EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：E7889-100ml）
可解决的（PerkinElmer，目录号：6NE9100）
Ketamin 10％（WDT，目录号：793-319）
Rompun ® 2％（拜耳）
脂溶液（见食谱）
麻醉（见食谱）

设备

Aquasafe 500 Plus（Gardner Denver Medical，ZINSSER ANALYTIC，型号：Aquasafe 500 Plus，目录号：1008500）
平衡（赛多利斯，产品目录号：BP 410 S）
移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus，目录号：3123000063），附有提示
Heraeus TM Fresco TM 21 Microcentrifuge，Max。 RCF：21,100 x g （Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Fresco TM 21，目录号：75002555）
氮气瓶中的氮气流（流速1.5 L / min）
Sonifier（Branson，型号：Digital Sonifier ® 450）
Sonifier Horn Double Step 1/8''Microtip（Branson，目录号：101-063-212）
Vortexer（IKA，型号：MS 1）
气候室（Memmert，型号：HPP750life）
Beta-Counter（PerkinElmer，型号：Tri-Carb ® 2810TR）

程序

rTRL的制备（参见图1的示意图）

图1. TRL准备的示意图
注意：所有步骤均在室温下通风橱和同位素实验室中进行。
1. 将脂质溶液（参见下面的食谱部分）添加到玻璃小瓶（每只小鼠2mg脂质）中，并确保至少准备3只小鼠。由于我们每只小鼠灌胃200μlrTRL，最小体积/小瓶将是4只小鼠（总终体积800μl），最大体积/小瓶将是20只小鼠（总终体积4ml）。
2. 在环境氮气流（1.5 L / min）下从脂质溶液中除去溶剂，直至玻璃瓶底部有脂质层（图2A）。
3. 每只小鼠加入50μl氯仿和18.5 KBq [4- 14 C] - 胆固醇到玻璃瓶中。
4. 通过在氮气流（1.5升/分钟）下蒸发脂质溶液再次除去氯仿，直到玻璃瓶底部再次出现脂质层（图1A）。
5. 为了形成rTRL，每只小鼠加入200μl0.9％NaCl溶液至脂质层，并用封口膜密封小瓶以避免在超声处理期间溢出（图2B）。
6. 小心地将小瓶放在超声波探头尖端下方。确保尖端不接触底部（图1B）。在第一次超声处理之后通过剧烈的涡旋步骤进行三次3分钟和20秒（20,000Hz，100W）的超声处理，直到液体具有乳状外观（图2C）。
7. rTLR颗粒必须新鲜制备，不得在一夜之间保存。
  
  图2. rTRL的制备。 A.将脂质溶液加入到玻璃小瓶中，在氮气流下蒸发溶剂，在玻璃小瓶的底部留下油性脂质层。添加放射性。将B和C.1.9％NaCl溶液加入到脂质层（B）中并超声处理以形成乳状rTRL乳液（C）。
胆固醇摄取试验
注意：所有步骤均在室温下在同位素实验室中进行。
1. 胆固醇摄取实验是在先前以温度中性（30°C）或冷（6°C）在湿度受控（55％）气候室中饲养7天的小鼠中进行的。
2. 在实验的早晨，将小鼠禁食4小时。为此，请从笼子中取出食物，并在早上刷新床上用品。
3. 禁食4小时后，将小鼠带到同位素实验室（室温）。
4. 对于管饲，将rTRL溶液填充到1ml注射器中（配备动物饲喂针作为尖端）。通过手抓住限制小鼠，小心地将喂食针放入口腔和食道，将200μlrTRL溶液（10 mg脂质/ ml和92.5 kBq / ml）直接倒入胃中。让小鼠再摄取4小时（始终提供水）。
5. 对于血液采集，准备1毫升注射器配备皮下注射针头，并用5μlEDTA填充。
6. 四小时后，通过i.p.深度麻醉小鼠。注射300μl麻醉剂（见下面的食谱部分）。
7. 当小鼠深度麻醉时，打开腹膜，从心脏取200μl血液，然后将血液加入Eppendorf管。
8. 取感兴趣的器官，注意湿器官的总重量，并在4℃下在单独的Eppendorf管中储存器官片（<180mg）直至进一步加工。
液体闪烁计数（参见图3的示意图）
注意：所有步骤均在室温下在同位素实验室中进行。
1. 通过在4℃，10,000 x g 下离心10分钟来制备血浆。取上清液作为血浆，并将血浆储存在4°C直至进一步处理。
2. 通过在60℃下振荡过夜，将器官碎片溶解在具有可溶解的（100μl/ 10mg器官）的2ml或15ml管中。对于闪烁计数，确保彻底均匀化解决的器官。
3. 取5μl或10μlrTLR溶液或10μl血浆和400μl器官溶液，在Pico Prias小瓶中加入4 ml Aquasafe 500 Plus。摇匀混合，静置1小时，然后进行液体闪烁计数（ 14 C cpm模式）。
  
  图3.液体闪烁计数的示意图

数据分析

来自计数器的原始数据在Microsoft Excel中处理。对于每个样品，测量每分钟计数两次并计算平均值。 rTRL溶液的示例性计算如下所述。如图4A所示，并且如所预期的，每个重复中的计数数量大致相等。此外，预计计数10μl的rTRL溶液将大致导致在5μlTRL溶液中检测到的计数的两倍，如图4A所示。另外，每μl的计算计数相等（图4B）。

图4. rTRL溶液中的计数。 A.一式五份计数5或10微升rTRL溶液，并检测每分钟计数。 B.计数5或10微升rTRL溶液并计算每分钟计数/μl。

然后计算每个器官的胆固醇摄取量（每个器官计数（计数除以器官块的质量），每个器官（每mg的数量×总器官重量）或给定剂量的百分比（每个器官的计数/给定的rTRL的计数）。
为了评估胆固醇摄入一周冷暴露小鼠的不同器官与温暖对照小鼠相比，我们使用7个生物学重复（每组7只小鼠）（Worthmann 等人，2017）。如Worthmann 等人的图1j / k所示，将胆固醇摄入器官表示为总器官放射性和给定剂量的％。温暖的对照组设定为100％。然后通过未配对的双尾学生 t - 测试计算器官放射性的统计学显着差异。冷暴露导致棕色脂肪组织和肝脏中胆固醇摄入增加（Worthmann et al。，2017）。

食谱

脂质溶液
注意事项：确保脂质溶液至少准备3次以上的小鼠。
1. 在2ml Eppendorf试管中提取每只小鼠2mg来自Intralipid 20％的脂质或来自1型高脂血症患者（之前在Bruns 等人 [2009]中描述的患者）的人TRL颗粒（制造）确定它最初来自Eppendorf，因为它耐溶剂）
2. 每份脂质溶液加入4份氯仿/甲醇（2：1v / v）并剧烈摇动
3. 然后向溶液中加入0.5份氯仿/水（1：1 v / v）并在18,000 x g 和4°C离心15分钟以使相分离
4. 用正常的Eppendorf移液器（体积100-1,000μl）小心地取下相，
5. 脂质溶液可以在-80℃的玻璃小瓶中储存长达一年
麻醉
在15毫升管中混合2.3毫升Ketamin，1毫升Rompun和6.7毫升0.9％NaCl

致谢

该方案改编自Bruns 等人（2009）和Worthmann 等人（2017）。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（SFB841;肝脏炎症：感染，免疫调节和后果）资助的资助。作者没有利益冲突申报。

参考

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