材料和试剂

20μl移液器吸头
离心管，50毫升
培养皿，圆形（60 mm x 15 mm）
花盆（直径25厘米）
灰褐色土（从杨凌麦田获得）
20 cm x 30 cm塑料袋（Tuopu Daily Chemicals Company，Miaojie，目录号：MBRL-A）
打孔器（直径：2 mm）
Miracloth（默克，目录号：475855-1R）
圆形牙签（yekee，目录号：Y-9892）
小燕22的开花期小麦（ Triticum aestivum ）品种（可根据要求提供）
F。 graminearum 野生型菌株PH-1（NRRL 31084）（可根据要求提供，Cuomo 等人，2007）
致病性缺陷型突变体 Fgkin1 （Luo et al。，2014）
尿素（GB 2004-2001）（陕西煤化工公司，华山）
羧甲基纤维素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C5678-500G）
硝酸铵（NH 4 NO 3 ）（Spectrum Chemical Manufacturing，目录号：YY975）
单磷酸钾（KH 2 PO 4 ）（广东光华科技，目录号：1.01863.020）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 •7H 2 O）（广东光华科技，目录号：1.03107.010）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（北京奥博兴生物科技有限公司，Aobox ®，目录号：02-023）
羧甲基纤维素液体培养基（CMC）（参见食谱; Cappellini和Peterson，1965）
PDA液体培养基（参见食谱;展位，1971）

设备

移液器（Gilson，20μl）
血细胞计数器（0.1 mm，1/400 mm 2 ）（QIUJING，型号：XB-K-25）
人工气候生长室（控制温度和湿度）（Percival Scientific，型号：E-36HO）
离心机（台式高速离心机，湘仪，型号：L530）
振荡器（振荡器 - 用于烧瓶，培英，型号：THC-C-1）
显微镜（奥林巴斯，型号：CX41RF）
相机（尼康，型号：D3000）

软件

SAS（统计分析系统，版本9.2）或R（版本R-3.5.0）

程序

小麦栽培

将6-8粒小麦种子放入盆中（直径25厘米），用2/3 Wheatfield土壤覆盖土壤（1.5-2厘米高）。向每个罐中加入0.5L H 2 O以使土壤湿润。
在生长室中培养植物，其光周期为16小时光照（20℃）/ 8小时黑暗（18℃），相对湿度为50-65％。
在2叶阶段约10-12天后，在20小时光照（13℃）/ 4小时黑暗（11℃），40-60％相对湿度下培养植物3周。每周浇水一次。
在4叶期（约5周龄植物）用额外的土壤覆盖根部，在每个盆中加入1.2g尿素并浇水。在20小时光照（16℃）/ 4小时黑暗（13℃）和40-60％湿度的光周期培养植物3周。每周浇水一次。
在孕穗期（约8周龄植物），在18小时光照（18℃）/ 6小时黑暗（16℃），40-60％湿度的光周期培养植物2周。，并在每个锅中加入1-1.5克尿素。每周浇水一次。
在开花阶段，在18小时光照（20℃）/ 6小时黑暗（18℃），湿度45-55％的光周期培养植物2周。使用大约11周龄的植物接种带有真菌分生孢子的小麦头。
接种前一天，将植物生长条件调整为16小时光照/ 8小时黑暗，25°C，湿度45-55％的光周期。

小麦头接种 F.禾本科

F的制备。禾本科分生孢子悬浮液
1. 准备PDA平板（6厘米），然后接种经测试的真菌 F.禾谷镰刀菌PH-1用无菌打孔器（直径约2毫米）放在PDA平板上的无菌工作台上，在培养箱中于25℃培养2-3天。
2. 将1/4 th 平方英寸的真菌塞从PDA平板转移到250ml锥形瓶中，在无菌工作台中加入50ml CMC液体培养基，并在25℃下以220rpm振荡培养。 3天。
3. 使用一层无菌miracloth过滤菌丝体，收集滤液，并洗涤菌丝数次。然后将滤液转移到50ml管中并在室温下以4,000 x g 离心8分钟（如果滤液体积超过50ml，重复该步骤）。
4. 小心丢弃液体上清液，用无菌水重悬分生孢子，用血细胞计数器计数分生孢子数，并将分生孢子浓度调节至1.5-2.0×10 5 / ml。
分生孢子接种
将10微升分生孢子悬浮液（1.5-2.0×10 5 / ml）接种到来自穗底部的第四或第五小穗的外and和内部中间的小花中（图1）。接种条件是在25℃，具有高的相对湿度，通过用塑料袋覆盖长钉以用于分生孢子萌发。接种后36小时取出塑料袋。每种菌株接种至少10个小麦头。在调查疾病指数之前，培养持续10-12天。

图1.小麦穗中分生孢子接种图。 A.将一滴（~10μl）分生孢子悬浮液注入小麦小穗的一小枝中。 B.放大的图显示了小麦穗中一个小穗的结构：1，外部颖片; 2，内层颖片; 3，小花; 4，引理; 5，Palea; 6，雄蕊; 7，雌蕊。

小麦头接种 F.禾谷镰刀琼脂圆片
该方法专门用于不产生分生孢子的突变菌株，尽管它也可以作为小麦头接种正常菌株的替代方法。

F. graminearum 琼脂圆片的制备
将3天病原体培养物的琼脂块（直径约2mm）接种到无菌台上的PDA平板（6cm）上，并在25℃下培养2-3天。使用无菌打孔器（直径约2毫米）切割平板琼脂以获得真菌琼脂块用于接种。
用真菌琼脂块接种
用牙签将真菌琼脂块（直径约2mm）接种到开花期从小麦底部开始的第四或第五小穗的外and和内pale中间的小花（图2）。将温室温度保持在25℃，并通过用塑料袋覆盖来保持钉的适当的高相对湿度以用于分生孢子萌发。接种后36小时取出塑料袋。在研究块接种结果之前，培养持续10-12天。每种菌株至少接种10个小麦头。

图2.小麦穗中接种真菌琼脂圆盘的图表。将菌丝琼脂圆盘（直径约2毫米）接种到一个小穗小花中。 1.菌丝琼脂圆盘; 2，牙签。

接种结果
接种后约10-12天，全麦头部通常通过接种分枝杆菌悬浮液或禾谷镰刀菌PH-1的琼脂块而患病，而只有一部分小麦头部患病。接种 Fgkin1 突变体（图3A）。没有观察到水控制的明显症状。

图3.小麦头部感染试验的疾病症状和统计分析。 A.开花的小麦头部用水（CK）或野生型PH-1和 Fgkin1的分生孢子接种突变体。黑色箭头表示接种的小穗。疾病指数估计为每个接种的小麦头上的患病小穗数。 B.箱形图比较接种的疾病指数与PH-1和 Fgkin1 突变体。数据点绘制为圆圈。指示来自学生 t -test的 P 值。

数据分析

疾病指数估计为每个接种的小麦头上的患病小穗数。通常，使用至少五个小麦头来计算疾病指数。可以计算平均值和标准偏差。在感染测定的例子中，PH-1的疾病指数达到12.6±1.5，而 Fgkin1 突变体的疾病指数仅为4.2±1.6。条形图或箱形图可用于比较不同接种的疾病指数。可以使用SAS或R中开发的学生 t - 测试来访问统计差异（图3B）。 P - 小于0.05的值被认为具有统计学意义。统计结果表明， Fgkin1 突变体的致病性显着降低。

笔记

根据小麦头的生长情况，可以增加或减少分生孢子悬浮液或真菌琼脂块的体积，但需要保持一致的变化。
用塑料袋覆盖小麦头时应小心，因为保持湿度是成功接种的关键步骤。固定袋子，不要伤害小麦。
接种后，小麦应每3-5天浇水一次。

食谱

CMC液体培养基（1升）
15克羧甲基纤维素（CMC）
1.0g NH 4 NO 3
1.0克K 2 HPO 4
0.5g MgSO 4 ·7H 2 O
1.0克酵母提取物
在添加其他成分之前，将CMC溶解在温暖的dH 2 O中在121℃下高压灭菌20分钟
PDA液体培养基（1升）
37.0克PDA粉末
将PDA粉末溶于沸腾的蒸馏水中，然后加入蒸馏水加至1L
在121°C高压灭菌15分钟

致谢

这项工作得到了中国自然科学基金（No. 31671981）的支持。我们要感谢王勤虎博士指导数据分析。作者宣称不存在竞争利益。

参考

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