材料和试剂

理大合成
1. 100 kDa Amicon过滤器（默克，产品目录号：UFC510096）
2. 6-8 kDa MW截止透析管（Repligen，Spectra / Por ®，目录号：132650）
3. Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363204）
  注意：我们不使用无RNase管，但在使用前始终对Eppendorf管进行高压灭菌。
4. RNase Inhibitor（罗氏诊断，目录号：03 335 399 001，储存于-20°C）
5. 来自Synechocystis sp的多核苷酸磷酸化酶（PNPase）。（Sigma-Aldrich，目录号：N9914-100UG，储存于-80°C）
6. 尿苷二磷酸酯（UDP，Sigma-Aldrich，目录号：94330，储存于-20°C）
7. 10-25 nt RNA种子寡核苷酸（IDT，DNA，在-80°C下储存在TE缓冲液中）
  注意：我们在实验中使用了20-nt长的polyU RNA种子寡核苷酸。
8. Tris碱（Merck，目录号：648310-2.5KG），用于制备缓冲液Tris pH 9
9. EDTA（Merck，Omnipur ®，目录号：4050-1KG）
10. 氯化镁六水合物（MgCl 2 •6H 2 O）（Merck，Omnipur ®，目录号：5980-500GM）
11. 盐酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：FLA144500）
12. 合成缓冲液（储存在4°C）（见食谱）
13. TE缓冲液（储存在4°C）（见食谱）
理大分馏
1. 100 kDa Amicon过滤器（默克，产品目录号：UFC510096）
2. 6-8 kDa MW截止透析管（Repligen，Spectra / Por ®，目录号：132650）
3. Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363204）
  注意：我们不使用无RNase管，但在使用前始终对Eppendorf管进行高压灭菌。
4. 透析管夹（Repligen，Spectra / Por ®，目录号：132743和132735）
5. 碳酸氢钠（默克，目录号：SX0320-1）
6. RNase Inhibitor（罗氏诊断，目录号：03 335 399 001，储存于-20°C）
7. 来自Synechocystis sp的多核苷酸磷酸化酶（PNPase）。（Sigma-Aldrich，目录号：N9914-100UG，储存于-80°C）
8. ssRNA ladder（New England Biolabs，目录号：N0362S，储存于-80°C）
9. 1％琼脂糖凝胶（在TAE缓冲液中制备，琼脂糖购自Merck，Omnipur ®，Calbiochem，目录号：2125-500GM）
10. Formamide（Acros organics，目录号：327235000，储存于4°C）
11. 凝胶红（Biotium，目录号：41001）
12. Tris碱（默克，目录号：648310-2.5KG），用于制备缓冲液Tris pH 8
13. 乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
14. EDTA（Merck，Omnipur ®，目录号：4050-1KG）
15. 氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S671-10）
16. 氯化钾（KCl）（默克，目录号：7300-500GM）
17. 氯化镁六水合物（MgCl 2 •6H 2 O）（Merck，Omnipur®，目录号：5980-500GM）
18. 盐酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：FLA144500）
19. TAE缓冲液（储存在4°C）（见食谱）
20. RNA装配缓冲液（见食谱）

设备

注意：所有产品在使用前都要经过高压灭菌或用70％乙醇冲洗。

Scalpel（手术设计，型号：SCALPEL＃15）
70％乙醇（我们用ddH 2 O稀释100％乙醇）（Decon Labs，目录号：V1001）
使用的微量移液器容量范围为1-1,000μl（Mettler-Toledo，Rainin，型号：Pipet-Lite XLS LTS）
微量移液器吸头：使用的体积范围为1-1,000μl（过滤的无菌气溶胶吸头，Rainin LTS吸管的高回收率; VWR，目录号：83009-688,82003-196,82003-198）
高压灭菌器
加热块（设定为70°C）（Fisher Scientific，目录号：11-718-2Q）
用于RNA工作的冰块或冷块（VWR，目录号：414004-285）
37°C培养箱（精度，目录号：51221089）
离心机可以达到5,000 x g （Eppendorf，型号：5804 R）
凝胶电泳设备
凝胶罐/盒组合（Fisher Scientific，目录号：FB-SB-710）
凝胶梳（Thermo Fisher Scientific，目录号：B1A-10和B1A-6）
电源（Fisher Scientific，目录号：FB1000Q）
层流罩，用于RNA工作
紫外灯，用于凝胶中ssRNA梯形成像（Spectronics，型号：ENF-260C）
Nanodrop，UV-Vis分光光度计，用于测量RNA浓度
Malvern粒度分析仪Nano-ZS
Milli-Q UV Plus（默克，产品目录号：ZD60115UV）

程序

注意事项：除非另有说明，否则样品保存在冰上，所有工作均在无菌层流罩中进行，以防止RNA污染。所有缓冲液，Eppendorf管和玻璃器皿在使用前均经过高压灭菌。

准备透析管
1. 准备2％碳酸氢钠溶液，1mM EDTA在玻璃烧杯中。
2. 将透析管切成4英寸的段，并在2％碳酸氢钠，1mM EDTA溶液中煮沸10分钟。用ddH 2 O彻底冲洗管子，然后在ddH 2 O中煮沸10分钟。＆nbsp;
3. 再次用ddH 2 O覆盖管道。高压灭菌，储存在4°C。
理大合成
注意：
1. 本文使用的合成方案是从Vanzi等人使用的现有方案开发的。（2003）和van den Hout等人。（2011年），并已用于我们最近发表的作品（Beren et al。，2017）。＆nbsp;
2. Synechocystis sp。的多核苷酸磷酸化酶用于从UDP单体聚合荧光polyU，其由短的'种子'寡核苷酸（500pmol的5'标记的cy5 polyU oligo 20-mer引发，但原则上，这可以是任何长度或序列）。 br />
1. 将500pmol种子寡核苷酸与20mM UDP，1μlRNase抑制剂和300ng PNPase在合成缓冲液中混合，总体积为80μl。在37°C孵育以开始反应。
2. 在37℃温育2小时后，UDP浓度增加至终浓度40mM。将溶液再孵育2小时，在37℃下共孵育4小时。＆nbsp;
3. 使用在5,000 x g 和4°C下操作6分钟的台式离心机，在100 kDa Amicon过滤器上用TE缓冲液彻底清洗产品三次。＆nbsp;
4. 通过测量UV-Vis吸光度来确定合成的polyU的量，并且使用260nm / 280nm处的吸光度比率作为RNA纯度的量度（A 260 / A 280 大于2.0）。
理大净化
1. 每个泳道的50微克荧光polyU在室温下在1％琼脂糖/ TAE RNA电泳凝胶上电泳，并在含有7μlstsRNA梯的2个外泳道上以90V电泳2小时。
2. 在加载到凝胶上之前，用甲酰胺（每个泳道70％的样品体积）使梯子变性并加热到70℃10分钟以消除所有二级结构。
  注意：我们发现polyU RNA不需要甲酰胺变性，因为在没有甲酰胺的情况下它已经缺乏二级结构。通常我们运行7μlssRNA梯，并加入15μl甲酰胺。
3. 断开电源后，将凝胶浸泡在TAE缓冲液中15分钟，使梯子重新形成二级结构，并用溴化乙锭（或等效的核酸染色剂）染色。
4. 从凝胶中切下含有500-1,500,1,500-2,500,2,500-3,500,3,500-5,000,5,000-7,000和7,000-9,000nt的polyU的级分，并在室温下90℃用TAE缓冲液电解到透析袋中1小时。 V.简言之，使用解剖刀切除对应于所需RNA长度的一部分凝胶，并将其置于透析管内，然后用透明管完全浸没所需的最小体积TAE填充。然后将这些管放回电泳槽中，所需的RNA从凝胶中洗脱出来并进入透析袋。重要的是，在电洗脱期间，凝胶被定向以产生RNA从切除的凝胶中洗脱的最短可能路径。（视频1）
  
  视频1.凝胶电洗脱协议。该视频说明了上述方法C（PolyU Purification）中所述的凝胶电洗脱步骤。该视频说明了步骤C4，其中切下含有所需RNA的凝胶部分，然后将RNA从该条带电洗脱到透析管中的TAE缓冲液中。
5. 电洗脱后，如上所述，使用100kDa Amicon过滤器用TE缓冲液洗涤RNA三次。使用260nm处的吸光度（使用40ng-cm /微升的消光系数）通过UV-Vis分光光度法测定polyU的浓度。随后通过RNA凝胶电泳验证电洗脱样品的纯度。
确定溶液中polyU的大小
1. 确定三个polyU的RNA级分（500-1,500，1,000-2,500和2500-3500核苷酸）和三个普通的组合物的RNA（3200-NT-长雀麦花叶病毒（BMV）RNA1，和它的两个截短的流体动力学半径即动态光散射（DLS）分别为500和2,000 nt长（见图3）（Hovanessian和Justesen，2007）。＆nbsp;
2. 在RNA装配缓冲液中，样品浓度为1 g / L的Malvern粒度分析仪Nano-ZS上进行这些测量（原始数据显示在图3A中）。图3B中的半径与半径相比表明，polyU半径表现出N 1/2 幂律定标，并且正常成分RNA表现出N 1/3 幂律定标，通过使用折叠算法的先前工作预测正常组成RNA的比例（Fang et al。，2011）。此外，polyU RNA的半径比相似长度的正常组合物的半径大约25％。
  
  图3.溶液中polyU大小的动态光散射测量。 A.polyU和BMV RNA 1的原始DLS数据（3,200nt长的正常组成RNA）。给出每个样品的给定流体动力学直径（nm）的分子部分。分布很宽，但测量之间的平均大小仍然存在。 B.显示polyU和正常组成RNA（500,2,000和3,200nt）的流体动力学半径如何随nt长度变化的图。通过数据绘制的品红色线表示N 1/2 幂律比例（polyU），而黑线表示预期的N 1/3 比例。具有二级结构的RNA。请注意，尽管原始数据表现出较大的标准偏差，但均值的标准偏差（误差条）相对较小，表明平均尺寸在测量中是可重复的。（改编自Beren et al。，2017）

笔记

该合成方案是稳健的并且具有与RNA转录相似的产率和再现性。
我们选择生产polyU而不是polyA，polyG或polyC，因为虽然所有RNA均聚物都缺乏自碱基对的能力，但polyU也表现出最弱的碱基堆积，导致polyU具有四个均聚物中最少的二级结构的RNA。
PNPase具有在没有模板的情况下合成多核苷酸的能力，并且还使用Alexa Fluor 488荧光fUTP合成polyU，产生具有低水平荧光UTP掺入的病毒长度RNA（数据未显示）。然而，这种合成方法没有在这项工作中进一步探索，因为它证明比本文所述的方案更困难。
从一个实验到另一个实验，分馏产率显着不同，产率范围为RNA的20％至70％。这种大的变化来自切除琼脂糖凝胶的窄带，最终结果是在分馏之间获得的polyU长度存在显着变化。另外，在分级过程中一切都必须清洁以防止polyU RNA降解是至关重要的。最后，尽可能将样品保存在冰上可以通过减少RNA降解显着提高分馏过程的产量。

食谱

注意：

使用以下缓冲区。将所有缓冲液高压灭菌并储存在4℃。所有缓冲液都使用来自Milli-Q UV Plus的ddH 2 O。
*使用盐酸将缓冲液调节至所需的pH值。

合成缓冲区
100 mM Tris碱pH 9 *
1 mM EDTA
5mM MgCl 2
TE缓冲区
10 mM Tris碱pH 7.5 *
1 mM EDTA
TAE缓冲区
40 mM Tris碱pH 8 *
20 mM醋酸
1 mM EDTA
RNA装配缓冲液
50 mM Tris碱pH 7.2 *
50 mM NaCl
10 mM KCl
5mM MgCl 2

致谢

作者贡献：所有作者都参与了实验的设计。 C.B.，L.D。和K.N.L.进行实验并分析数据。 C.B.，W.G。和C.K.一起写了这篇文章。
该协议改编自Beren 等人（2017）。
该研究得到了NSF的资助CHE1051507的支持。在这项工作的过程中，安进学者计划支持KNL。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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Yoffe，A.M.，Prinsen，P.，Gopal，A.，Knobler，C.M.，Gelbart，W。M.和Ben-Shaul，A。（2008）。预测大RNA分子的大小。 Proc Natl Acad Sci USA 105（42）：16153-16158。