材料和试剂

种子灭菌和接种：

1.5 ml反应管（BRAND，目录号：780400）
Parafilm（Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1472）＆nbsp;
家用铝箔，或多种用途的重型箔
无菌滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-090）
灌封混合物（例如，Klasmann和Deilmann，Substrat 1.090）
显微镜载玻片（Carl Roth，目录号：0656.1）
显微镜载玻片盖玻片（Carl Roth，目录号：0657.2）
金属手术刀10621的替换刀片No.11（DAHLE，目录号：10722）
根训练器或盆（GärtnerPötschke，目录号：280686）
草种子（在这里使用： Lolium perenne cv Samson种子，内生真菌; Agricom，新西兰）
Epichloë菌株， E. festucae Fl1（ATCC，目录号：MYA-3407）
蒸压蒸馏水＆nbsp;
Murashige和Skoog Medium含维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0222）
Phyto琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1003）
马铃薯葡萄糖琼脂（Carl Roth，目录号：X931）
Agar-Agar（Carl Roth，目录号：6494）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：793566）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：746436）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：795410）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
硫酸（H 2 SO 4 ）（西格玛奥德里奇，目录号：339741）
次氯酸钠（NaClO + H 2 O; 12％Cl 2 ）（Carl Roth，目录号：9062.3）
氢氧化钾（KOH）（Carl Roth，目录号：6751）
95％乙醇（Carl Roth，目录号：9065）
吐温20（Carl Roth，目录号：9127）
甘油（Carl Roth，目录号：7530）
苯胺蓝二铵盐（C 37 H 32 N 5 9 S 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：415049）
小麦胚凝集素，Alexa Fluor TM 488结合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：W11261）
碘化丙啶溶液0.5 mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
3％水琼脂（见食谱）
2.4％马铃薯葡萄糖琼脂（见食谱）
Murashige和Skoog植物琼脂（见食谱）
苯胺蓝二铵盐原液（见食谱）
WGA-AF488原液（见食谱）
PBS（pH 7.4）（见食谱）
吐温20库存（见食谱）
染色液（见食谱）

设备

冰箱
孵化器（Thermo Fisher Scientific，Heraeus，型号：BK 600）
立体显微镜（徕卡，型号：Leica S6 D）
金属手术刀（DAHLE，目录号：10621）＆nbsp;
保存罐子
高压灭菌器
不锈钢镊子（Sigma-Aldrich，目录号：Z168777）
Thermos Scientific“先生Frosty“冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5100-0001）
层流气流柜
共聚焦激光扫描显微镜，CLSM，（徕卡，型号：Leica TCS SP5和Leica TCS SP8）
干燥器基座（DWK Life Sciences，DURAN ®，目录号：247714605）
干燥器盖（DWK Life Sciences，DURAN ®，目录号：244204605）
带PTFE主轴的活塞（侧面）（DWK Life Sciences，DURAN ®，目录号：247980306）
带PTFE主轴的旋塞阀（顶部）（DWK Life Sciences，DURAN ®，目录号：247990401）
水射流过滤泵（BRAND，目录号：159600）

程序

种子表面灭菌（改编自Latch和Christensen，1985）
1. 将种子浸泡在硫酸（H 2 SO 4 ）50％（v / v）中30分钟。
2. 每次用自来水冲洗种子3次，每次2分钟。
3. 将种子浸泡在NaClO 13％（w / v）中30分钟。
4. 从现在开始在无菌条件下工作。
5. 用无菌蒸馏水冲洗种子。 3次，每次2分钟。
6. 将种子放在灭菌的滤纸上，在层流下的无菌培养皿中风干
  注意：大约需要2小时。
7. 干燥的种子可以储存在4℃的冰箱中用Parafilm密封的无菌培养皿中长达3个月。但是，请注意种子的发芽率可能会在长期储存后下降（图1A）。
多年生黑麦草幼苗的制备改编自（Latch和Christensen，1985）
1. 将表面灭菌的种子放在含有3％（w / v）水琼脂的培养皿上。每个板最多可添加10粒种子。确保种子朝向相同方向。当种子放置时，接种是最容易的，其中凹面朝上并且楔形的小龙虾片段位于底部（图1B）。每个小花出生在称为小穗轴的分段中心轴上，并且每个种子保留其小穗轴段。
2. 通过将培养皿包裹在铝箔中，将种子置于20-22℃的黑暗中。确保平板位于其侧面，种子位于底部，并且在整个种子发芽过程中平板保持在该位置。
3. 将用于接种的真菌菌株继代培养到新鲜的厚PDA板上。不要在12厘米的培养皿上放4个以上的琼脂。用Parafilm密封培养皿，在20°C温育，底部朝下（图1C）。为了长期储存真菌菌株，在2ml PD肉汤中研磨1cm 2 新鲜生长的菌丝体。让菌丝体在室温下生长3-5天。加入2.5毫升30％甘油，并将750微升等分试样的菌丝体分配到Eppendorf管中。使用冷冻容器（例如，Frosty先生）缓慢均匀地冷冻培养物。将管储存在-80°C。
4. 7-8天后，将发生种子萌发，枝条长度范围为4厘米至7厘米（图1D）。
  
  图1.多年生黑麦草种子的制备和 Epichloë 菌丝体。 A.灭菌和干燥的种子。 B.将种子置于3％水琼脂上。 C. E. PDA琼脂上的festucae Fl1菌丝体在20℃下生长一周。 D.在3％水琼脂上一周后发芽的黑麦草。 E.接种后污染的板。白色箭头表示 E. festucae Fl1菌丝体从接种点长出，蓝色箭头表示从种子中长出的污染物。 F.接种后一周未受污染的平板。白色箭头表示 E. festucae Fl1菌丝体。＆nbsp;
接种多年生黑麦草幼苗（改编自Latch和Christensen，1985）
1. 使用无菌手术刀和解剖显微镜（图2A），在幼苗中胚轴和胚芽鞘之间的发育中的顶端分生组织处切割2-3mm纵向切口。在整个过程中，幼苗保持在水琼脂上。使用锋利的手术刀片，当它变钝时，大约每20-30个幼苗更换一次。
2. 将从菌落边缘切下的新鲜生长的菌丝体的小块（约2mm×2mm）插入幼苗的狭缝中（图2B）。一旦你习惯了这个程序，并且能够快速工作（菌丝体不会变干），你可以将几片菌丝放在叶片上，然后将它们一个接一个地插入幼苗的缝隙中。步骤C1和C2显示在视频1和2中。
  
  视频1.菌落块从菌落边缘切下
  视频2.将菌丝体置于手术刀刀片上并在切除顶端分生组织中的小切口后直接插入
3. 将幼苗在20-22℃的水琼脂平板上孵育在黑暗中另外7天（图1F）。 2天后检查幼苗是否有污染（图1E）。电子。 festucae 菌落从接种点生长出来，同时从种子中生长出更快的真菌污染物。将幼苗转移至光照（16小时光照的光周期）并在20-22℃下再孵育7天。用Parafilm密封培养皿。
4. 将幼苗转移到含有Murashige和Skoog Phyto琼脂的无菌盆（例如，保存罐）中（图2C）。用镊子轻轻将种子和根部推入琼脂中。或者：将幼苗转移到含有盆栽混合物的根训练器（图2D）。
5. 将植物置于温室或环境控制的生长室中，温度为20-22°C，光周期为16小时（约100μmolm -2 sec -1 ）。定期检查无菌罐中的植物是否有污染。＆nbsp;
6. 在6-8周后（图2E），或当一个以上的新草梢，分蘖（图3A）已经发育时，检查植物是否被苯胺蓝染色或通过免疫印迹感染（Florea 等。，2015）。将幼苗移植到单个盆中以进一步生长。
  
  图2.接种多年生黑麦草幼苗和植物栽培。 A.在层流柜下设置解剖显微镜。 B.接种一小块 E. festucae 菌丝体进入SAM制作的小切口，可见小结。 C和D.接种后两周（在黑暗中一周，在光照下一周）植物幼苗在无菌罐中或在盆栽混合物中的根培训器中。 E.当几个分蘖发展时检查是否感染。
用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的多年生黑麦草内生菌的染色
1. 将分蘖切成接近感染的黑麦草植物的根部（图3A）。
2. 从舵柄上剥下最外面的叶鞘并丢弃（图3B），切开约。从假茎的基部开始的2厘米大小的片断并丢弃它。切下2-3厘米的假茎（图3C 1）。将该部分纵向切成两半（图3D）。
3. 在叶舌周围切一块2厘米（图3C 2）。
4. 从刀片上切下2厘米的部分（图3C 3）。
5. 将植物组织放入含有95％EtOH的Eppendorf管中，并在4℃下浸泡过夜（图3D）。步骤D2-D5显示在视频3中。如果叶子仍然是深绿色，则将它们转移到新鲜的95％EtOH中以清除植物样品中的过量叶绿素。
  
  视频3.准备叶子样本进行清除和染色
6. 除去乙醇并用10％KOH处理3小时。 KOH溶解植物细胞壁多糖，这使植物细胞壁软化并允许WGA-AF488，AB和PI渗透。
7. 用1 ml PBS（pH 7.4）彻底清洗组织三次;任何剩余的KOH都会破坏染色程序。
8. 将样品在新制备的染色溶液中孵育30分钟（图3E），包括真空渗透步骤（图3F和3G;视频4）。在真空渗透过程中打开1.5毫升杯子的盖子。为了防止损坏干燥器，应小心地打开和关闭盖子，而不是直接放在设备上。真空在约16毫巴下渗透样品2分钟。（根据制造商的说法，在各种供水范围内达到16 mbar [水温12°C]的极限压力）。您可以通过小心地试图取下腔室的盖子来检查真空。两分钟后缓慢通风室，以避免破坏植物组织。重复真空渗透和通风步骤两次。真空渗透程序如视频4所示。请注意，我们加快了视频中样本的孵化时间。
  
  图3.用于CLSM的多年生黑麦草内生菌的染色。：一种。切割靠近根部的分蘖。分蘖可以分成三部分，假茎（1），包含叶片分生组织（2）的叶舌周围区域和叶片（3）。 B.剥去最外面的叶鞘并丢弃。 C.从假茎（1）的基部，叶舌（2）周围的区域和刀片（3）切下2cm大小的片。 D.将假茎部分（1）纵向切成两半。 E.将叶子样品在95％乙醇中孵育过夜，用10％KOH处理3小时，然后用PBS洗涤三次。 F.准备染色溶液。 G.真空渗透样品。
  
  视频4.真空渗透染色草内生菌。通过转动上部旋塞来密封盖子。打开将腔室连接到水射流泵的侧面旋塞。打开水，现在对腔室施加真空。几秒钟后检查确定真空，你不能向左或向右滑动盖子。等2分钟。为了使腔室通风，关闭侧面旋塞以避免水被吸入腔室。关掉水。慢慢打开盖子上的上部旋塞。当空气流入腔室时，您应该听到嘶嘶声。再重复两次这个过程。
CLSM可视化
1. 将样品安装在带盖玻片的载玻片上，用于共聚焦显微镜检查。添加一滴50％甘油用于长期观察，以防止样品变干。甘油具有与水不同的折射率，短期观察使用水代替甘油。使用镊子小心地将叶子样品放在载玻片上。叶片倾向于折叠，因此您可能需要使用两个镊子将它们小心地分开。建议在解剖显微镜下进行制备。
2. 与488nm氩离子和561nm二极管泵浦固态（DPSS）激光器同时激发AB，WGA-AF488（和PI）。
3. 使用三个检测器捕获染料的发射荧光以及植物自发荧光。使用蓝色伪彩色（PMT1,498-551nm）用于用488nm氩离子激光器激发的WGA-AF488的发射荧光。使用绿色（PMT2或HyD1,593-625 nm）和红色（PMT3,661-796 nm）假色，用于苯胺蓝，植物自发荧光和碘化丙锭的发射荧光，这是由561 nm DPSS激光激发产生的（图4）。 br />
  
  图4. E的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。硬羊茅中的festucae 。 A.用WGA-AF488，苯胺蓝和碘化丙啶染色的CLSM（此处使用Leica TCS SP8显微镜）的设置。 B和C.CLS显微照片描绘了用探测器（PMT 2，PMT 4和HyD 3）捕获的不同和合并的荧光信号，其捕获限定波长的光（如A中所示）。还示出了用于激发样品的激光。（B） E的内生菌丝（h）。 Festuca trachyphylla 叶片的植物细胞（pc）之间的Festucae Fl1。由488nm氩离子激光器激发的WGA-AF488的发射荧光通过PMT 2和HyD 3检测器通过荧光发射的交叉捕获。 WGA-AF488染色仅存在于内生菌丝的隔片（星号）中的几丁质，植物细胞未被染色。用HyD 3检测器捕获由561nm DPSS激光激发的AB，PI和植物（叶绿素）自发荧光的发射荧光。 PI染色内生菌丝的细胞核（散列）。 AB在真菌（小箭头）和植物细胞壁（大箭头）中染色β-D-1,3-葡聚糖。用HyD 3和PMT 4检测器捕获叶绿素和真菌细胞质的自发荧光。注意，绿色（HyD 3）和红色（PMT 4）伪彩色在合并图像中组合成橙色。（C） E的附生菌丝（h）。 Festuca trachyphylla 叶片上的festucae Fl1。 WGA-AF488在隔膜（星号）和叶生菌丝的细胞壁（小箭头）上染色几丁质。用PMT 2捕获的弱WGA-AF488信号表明这里显示的菌丝刚开始在细胞壁上暴露和/或积累几丁质。 HyD 3检测器捕获PI核信号（散列），隔膜和细胞壁（星号）的WGA-AF488信号和AB染色的真菌细胞壁（小箭头）。 PMT 4检测器捕获AB染色的真菌细胞壁（小箭头）和真菌细胞质（箭头）。比例尺：B =20μm，C =5μm。

数据分析

图像处理（LAS AF和ImageJ）用于增强图像质量。如有必要，我们会调整合并图像的对比度和亮度。＆nbsp;
该方案可用于观察早期感染阶段（图5），内生和附生的菌丝以及表达（图6）和植物的胼deposition质沉积（图7）。通过向染色溶液中添加碘化丙啶使核可视化（图6C和6E）。

图5. E对多年生黑麦草的早期感染。 festucae Fl1。接种后两周取样并用WGA-AF488和AB染色。 A.在接种方拍摄的图像。 WGA-AF488染色叶绿素菌丝中的几丁质以及 E的内生菌丝的隔膜。 festucae 。 B.内生菌丝定植叶原基。用AB染色的内生菌丝的细胞壁葡聚糖以橙色显示，隔膜和叶生的菌丝以蓝色显示。比例尺=20μm。

图6. E的内生和附生菌丝。 festucae 与多年生黑麦草有关。接种后两周取样，用WGA-AF488和AB（A，B，D，F）和WGA-AF488，AB和PI（C，E）染色。 A.叶鞘中的内生菌丝。内生菌丝的细胞壁用AB染色，隔膜中的几丁质用WGA-AF488染色，显示为蓝色，并用星号标记。植物叶绿体的自发荧光以橙色显示。 B.叶片内生菌丝;请注意，海绵叶肉之间的菌丝不直。染色和假色素与A.C.内生菌丝在叶片中一样，另外用PI染色以显示细胞核。真菌核呈黄色，用箭头标出。植物细胞核以黄色显示并用哈希符号标记。 D.内生菌丝的细胞壁未被WGA-AF488染色，因此在从AB染色的植物中出芽后出现菌丝，以红色假彩色显示并用箭头标记。叶鞘上的叶生细菌的细胞壁和隔膜含有用WGA-AF488染色的几丁质，以蓝色显示，隔膜用星号标记。 E.叶片上的附生菌丝，真菌核另外用PI染色（箭头）。注意，菌丝细胞壁在外表面上出现后不久不含几丁质，因此只有隔膜与WGA-AF488结合并呈现蓝色（星号），而真菌细胞壁被AB染色并显示为红色。 F.在叶片分生组织附近的Expressorium破裂角质层，显示绿色自发荧光。比例尺=20μm。

图7.多年生黑麦草细胞壁产生胼。质接种后8周取样，用WGA-AF488和AB染色。 A. E. festucae - 在胞间连丝中产生独立的胼call质; E的内生菌丝。 festucae 野生型Fl1以橙色显示，隔垫以蓝色显示; A1。箭头指向胼;; A2。艺术家对A1的看法，其中以图形方式添加植物中间薄片和细胞壁。 B. E. festucae Δ noxA 突变体诱导形成胼call乳头（星号），其中菌丝离开植物;叶生菌丝以蓝色显示。 C-即 E中的胼pap乳突。 festucae Δ noxA 突变体（C），在 E中。 festucae Δ noxB 突变体（D），在 E中。 festucae Δ noxR 突变体（E）。升。 perenne 以类似的方式对所有nox突变体的愈伤组织产生的诱导作出反应。比例尺A =10μm，B =100μm，C-E =20μm。

笔记

当接种内生菌突变体时，使用在不含抗生素的PD上生长的菌丝体，因为抗生素会杀死幼苗。
感染数量取决于您的接种技能和植物基因型以及Epichloë菌株。我们通常使用 E获得50-80％的受感染植物。 festucae Fl1和 L. perenne 参孙。我们最近成功接种了 E. festucae Fl1 in Festuca trachyphylla 。

食谱

3％水琼脂
在1升蒸馏水中加入30克琼脂
在121°C高压灭菌20分钟并倒入平板
平板可以存放在冰箱中长达两周
2.4％马铃薯葡萄糖琼脂
将24克马铃薯葡萄糖琼脂溶于1升蒸馏水中
在113℃下高压灭菌20分钟并倒入板
平板可以存放在冰箱中长达两周
Murashige和Skoog植物琼脂（1升）＆nbsp;
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Murashige和Skoog Medium含维生素
4.3克
Phyto琼脂
7.5克 > ＆nbsp;在蒸馏水中补充1升
在113°C高压灭菌20分钟，然后倒入保存罐中。高4至5厘米。
苯胺蓝二铵盐原液
将0.01克苯胺蓝二铵盐溶于1毫升Milli-Q水中在室温下储存
WGA-AF488库存解决方案
将0.001克WGA-AF488溶于1毫升Milli-Q水中在-20°C下避光保存
PBS（pH7.4）（1L）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>NaCl
8.0克
KCl
0.2克
Na _{2 HPO _{4
1.44克
KH _{2 PO _{4
0.24克 > ＆nbsp;在蒸馏水中补充1升
将pH调节至7.4}}}}
吐温20股票
通过添加20μlTween20至980μlMilli-Q水制备1 ml原液
在室温下储存
染色液（1毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>苯胺蓝色二铵盐原液
20μl
WGA-AF488原液 5μl
碘化丙啶溶液
2μl
吐温20库存解决方案
10μl
> ＆nbsp;在PBS（pH 7.4）中加入1 ml
在使用当天新鲜

致谢

该协议改编自Latch和Christensen（1985）和Becker 等人（2016）。我们要感谢Karolin Warnecke提供的出色技术支持。我们非常感谢来自生物保护研究中心和皇家学会TeApārangi的马斯登基金会的资助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

Becker，M.，Becker，Y.，Green，K。和Scott，B。（2016）。内生共生体Epichloëfestucae在表面上建立了一个附生网em> Lolium perenne 通过开发一种类似附着胞的叶片出口结构而离开。 New Phytol 211（1）：240-254。
Figueroa-Lopez，A。M.，Cordero-Ramirez，J。D.，Quiroz-Figueroa，F.R。和Maldonado-Mendoza，I.E。（2014）。高通量筛选试验，以鉴定针对 Fusarium verticillioides 的细菌拮抗剂。 J Basic Microbiol 54 Suppl 1：S125-133。
Florea，S.，Schardl，C。L.和Hollin，W。（2015）。检测和分离Epichloë物种，草的真菌内生菌。 Curr Protoc Microbiol 38：19A 11 11-19A 11 24。
Latch，G。C. M.和Christensen，M。J.（1985）。内生菌对草的人工感染。 Ann Appl Biol 107（1）：17-24。
Scott，B.，Becker，Y.，Becker，M。和Cartwright，G。（2012）。草共生体的形态发生，生长和发育Epichlöefestucae 。在：Martín，JP和Pietro，AD（编辑）。真菌的形态发生和致病性。施普林格，243-264。
Wood，P。J.和Fulcher，R。G.（1984）。苯胺蓝与（1→3）-β-D-葡聚糖的特异性相互作用。碳水化合物聚合物 4：49-72。