材料和试剂

5毫升，2毫升和1毫升玻璃移液器（Borosil）
滤纸40（GE Healthcare，Whatman，目录号：1440-110）
50毫升刻度离心管，PP（Tarsons，目录号：546041）
带有250μl玻璃插入物的2 ml GC样品瓶和瓶盖（Agilent Technologies，目录号：5190-2240）（Agilent Technologies，目录号：5181-1270）
Pyrex培养管，带PTFE衬里的螺旋盖（Corning，目录号：9826-13）
植物组织（叶，茎，根和果实）
液氮
氮气（纯度> 99％）
HPLC级甲醇（Merck，目录号：1060020500）
HPLC级氯仿（默克，目录号：1024470500）
HPLC级水（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：1.00577.2500）
HPLC级正己烷（Sigma-Aldrich，目录号：34859）
磷酸二氢钾，ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
磷酸氢二钾，ACS试剂，≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
F.A.M.E. Mix，C4-C24（Sigma-Aldrich，目录号：18919-1AMP）
十九烷酸（Sigma-Aldrich，目录号：N5252）
溶剂萃取溶液A（见配方1）
溶剂萃取溶液B（见配方2）
甲醇NaOH（见食谱3）
甲醇HCl（见食谱4）
内标（见食谱5）

设备

50毫升烧瓶（Borosil）
漏斗（Borosil）
台式离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-30KS）
样品浓缩器（杭州奥盛仪器，目录号：MD200-2）
VacSeal液氮杜瓦瓶（Jencons-PLS，目录号：238-112）
台式旋转涡旋（Tarsons，目录号：3002）
Rotospin-Rotary混合器（Tarsons，目录号：3092）
摇水浴（JULABO，目录号：SW23）
-20°C新不伦瑞克高级冰柜（Eppendorf）
-80°C新不伦瑞克高级冰柜（Eppendorf）
GC-MS（Shimadzu，型号：GCMS-QP2010）与质谱仪配合使用，配备自动进样器（AOC-5000）和火焰离子化检测（FID）
平衡（Sartorius，型号：BSA2 24S-CW）
RTx-5MS毛细管柱（60米，0.25 mm内径和0.5μmdf）（Rastek，目录号：13455）

软件

GC-MS解决方案2.70版，运行后分析
Excel软件（Microsoft Office 2010）

程序

从植物组织中提取脂质（图1）
1. 收集植物组织（叶/茎/根/果实）并在液体N 2 中快速冷冻样品。为了对脂肪酸进行绝对定量，在冷冻样品之前快速准确地确定植物材料的准确鲜重（FW）。将样品保存在-80°C的铝箔中，直至进一步使用。
  关键步骤：为获得满意的GC-MS信号，需要足够的植物材料。通常，100.00至500.00毫克组织足以分析脂肪酸含量。在该方案中，收集约200mg组织作为一个样品。
  暂停点：冷冻样品可以在-80°C下储存。
2. 使用研钵杵将约200.00mg植物组织在液体N 2 中均化，并将粉末转移至50ml刻度离心管中。
3. 加入5ml预冷（4℃）溶剂萃取溶液A（参见配方1）并剧烈旋转3分钟。
4. 将样品在4℃下以10,000 x g 离心10分钟，并将上清液收集在50ml烧瓶A中。
5. 将2.5ml预冷的溶剂萃取溶液B（参见配方2）加入沉淀中并剧烈涡旋。
6. 在4℃下以10,000 x g 离心样品10分钟，并将上清液转移到50ml烧瓶A中（重复步骤A5-A6）。
7. 使用漏斗通过重力过滤法通过Whatman滤纸40过滤合并的上清液，并通过与等体积的磷酸钾缓冲液（50mM; pH-7.5）混合进行洗涤。
8. 将混合物在10,000℃下在4℃下离心10分钟，并将下层有机相收集到50ml刻度离心管中。用玻璃吸管收集下相。
9. 使用样品浓缩器在N 2 下干燥总脂质，并通过重量分析确定总脂质含量。
  暂停点：在进一步分析之前，总干燥脂质可以储存在-20°C。
图1.从植物组织中提取总脂质的工作流程

通过转甲基作用将脂质转化为脂肪酸甲酯（FAME）（图2）
1. 将约1-10mg总脂质溶解在1ml甲醇NaOH中（参见配方3）并在Pyrex培养管中转移。
2. 在55℃的水浴中加热15分钟。
3. 加入2毫升甲醇HCl（见配方4）并涡旋20秒。
4. 再次在55℃的水浴中加热15分钟。
5. 将10μl的1mg ml -1 十九烷酸（C19：0）加入到脂质样品中作为内标。
6. 通过加入1ml水（Milli Q），通过Rotospin-Rotary混合器（Tarson）提取FAME，随后加入2ml 100％己烷。
7. 将上相（~2ml）转移到新鲜的Pyrex培养管中。
8. 在相同的Pyrex培养管中用2ml 100％己烷和池提取FAME两次（步骤B7）。
9. 在N 2 下干燥合并的FAME，最后溶解在100μl的100％己烷中。
10. 将由此洗脱的FAME转移到玻璃插入物中，转移到2ml透明GC小瓶中。
  暂停点：样品可以在-20°C的加盖小瓶中保存一个月。
图2.通过甲基转移将脂质转化为脂肪酸甲酯（FAME）的工作流程

GC-MS分析（图3）
1. 使用配备有自动进样器（AOC-5000）的质谱仪（GC-MS QP-2010，Shimadzu，Japan），使用火焰离子化检测（FID）和RTx-进行FAME样品的GC-MS分析。 5MS毛细管柱（表1）。
2. 使用来自美国Rastek的RTx-5MS毛细管柱（60米，0.25 mm内径和0.5μmdf），1 ml min -1 氦气流速（纯度99.9％）作为载气，柱前压力为112.9kPa。将初始柱温度方案设定为40℃3分钟，然后将5℃min -1 增量设定至230℃，然后在230℃下保持40分钟。然后，将注射量，时间和温度分别设定为1μl，67 min和230°C。以电子能量为70 eV的电子紧凑模式操作质谱仪，并将离子源和四极杆的温度保持在200°C。
图3. GC-MS运行和运行后数据分析的工作流程

表1.用于测定脂肪酸组成的GC-MS操作条件＆nbsp;

数据分析

使用日本Shimadzu的运行后分析（GC-MS QP-2010）进行峰发现，峰积分和保留时间校正。
通过GC-MS运行后分析将相应的FAME和保留时间指数与标准品（FAME Mix C4-C24，Supelco，USA和7-十六烯酸甲酯，Cayman Chemicals，USA）进行比较。
接下来，将积分相对峰值相对于FAME混合标准信号归一化。
使用Microsoft Office Excel 2010通过每种脂肪酸的相对峰面积的面积归一化来量化脂肪酸。图4显示标准（FAME混合物）和植物叶的总离子色谱图的代表性差异峰面积。

图4.代表性总离子数（TIC）色谱图。 A.标准; B. Leaf。
总饱和脂肪酸（SFA）和不饱和脂肪酸（MUFA和PUFA）含量通过相应脂肪酸的百分数量的总和来估算（Patel 等人，，2016）。不饱和指数（Poerschmann et al。，2004），不饱和度（Ramos et al。，2009），致动脉粥样硬化和血栓形成指数（Simat 等。，2015）使用以下等式计算：

食谱

溶剂萃取溶液A
氯仿：甲醇，1：2（v / v）
溶剂萃取溶液B
氯仿：甲醇，1：1（v / v）
甲醇NaOH
1％NaOH的MeOH溶液该溶液可以在4°C下储存至一个月
甲醇HCl
5％浓度HCl的MeOH溶液（浓HCl-36％;摩尔浓度：11.65）
该溶液可以在4°C下储存至一个月
内部标准
1毫克毫升 -1 十九烷酸（C19：0）

致谢

MKP承认SERB-科学与技术部的国家博士后奖学金（PDF / 2016/001971）。科技（DST），政府。印度支持这项工作。国家植物基因组研究所（NIPGR）的核心资助也得到了认可。 SD承认政府生物技术部（DBT）的初级研究奖学金。印度我们感谢DeLCON提供给我们的研究文献。该协议源自Bligh和Dyer（1959）以及Carreau和Dubacq（1978），由Mishra 等人做出的微小修改（2015），Pandey 等。（2015）和Patel 等。（2016）可获得可重复的结果。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Carreau，J.P。和Dubacq，J.P。（1978）。将宏观尺度方法应用于生物脂质提取物脂肪酸甲酯酯交换的微观尺度。 J Chromatogr A 151（3）：384-390。
Hadar，Y。（2013）。用于生产乙醇的木质纤维素原料来源。 Springer Berlin Heidelberg 。
Knothe，G。（2005）。生物柴油燃料特性对脂肪酸烷基酯结构的依赖性。 Fuel Process Technol 86（10）：1059-1070。
Kumari，P.，Bijo，A.J。，Mantri，V.A.，Reddy，C.R。和Jha，B。（2013）。热带海洋大型藻类的脂肪酸分析：从化学分类学和营养学角度分析。 Phytochem 86：44-56。
Mishra，A.，Patel，M。K.和Jha，B。（2015）。活性氧物种的非靶向代谢组学和清除活性揭示了 Salicornia brachiata的潜力作为功能性食品。 J Funct Foods 13：21-31。
Pandey，S.，Patel，M.K.，Mishra，A。和Jha，B。（2015）。孜然的生理生化成分和非靶向代谢组学（ Cuminum cyminum L. ）使其成为有前景的功能性食品，并帮助减轻盐分压力。 PLoS One 10（12）：e0144469。
Patel，M.K.，Mishra，A。和Jha，B。（2016）。非靶向代谢物分析和清除活性揭示车前子的营养保健潜力（车前子 Forsk）。 Front Plant Sci 7：431。
Poerschmann，J.，Spijkerman，E。和Langer，U。（2004）。 Chlamydomonas sp。中的脂肪酸模式。作为极端酸性条件下营养方案和温度的标记。 Microb Ecol 48（1）：78-89。
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Ryckebosch，E.，Muylaert，K。和Foubert，I。（2012）。优化从微藻中提取脂质的分析程序。 J Am Oil Chem Soc 89（2）：189-198。＆nbsp;
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Sheng，J.，Vannela，R。和Rittmann，B。E.（2011）。评估从 Synechocystis PCC 6803中提取和定量脂质的方法。< / a> Bioresour Technol 102（2）：1697-1703。
Simat，V.，Bogdanović，T.，Poljak，V。和Petričević，S。（2015）。 bogue的脂肪酸成分，致动脉粥样硬化和血栓形成健康脂质指数和脂质稳定性的变化（在冰上储存期间，Boops boops Linnaeus，1758）：鱼类养殖活动的效果。 J Food Compos Anal 40：120-125。