材料和试剂

Avant 1.7 ml微量离心管（MIDSCI，目录号：AVSS1700）
移液器吸头，20μl（Rainin Instrument，LLC，目录号：17005091）
移液器吸头，250μl（Rainin Instrument，LLC，目录号：17005093）
剃刀刀片（Fisher Scientific，目录号：12640）
微量离心管架（Fisher Scientific，目录号：22-313630）
Scotch双面胶带，¾英寸x 400英寸（3M）
显微镜载玻片，3英寸x 1英寸（Fisher Scientific，目录号：12518100A3）
盖玻片，编号1.5,30 mm x 22 mm（Fisher Scientific，目录号：12544A）
Filter forcep（默克密理博中国，目录号：XX6200006P）
Kimwipe（Fisher Scientific，目录号：06666A）
显微镜镜头纸，4英寸x 6英寸（Fisher Scientific，目录号：11996）
<未标记的猪微管蛋白> 99％纯度，1毫克（Cytoskeleton，Inc。，目录号：T240）（储存在-80°C）
HiLyte Fluor 488标记猪微管蛋白，20μg（Cytoskeleton，Inc。，目录号：TL488M）（在-80°C保存）
罗丹明标记的猪微管蛋白，20μg的（细胞骨架，公司，目录号：TL590M）（储存在-80℃）
100 mM GTP（Cytoskeleton，Inc。，目录号：BST06-010）（ - 20°C保存）
10 mM Taxol（Cytoskeleton，Inc。，目录号：TXD01）（ - 20°C保存）
Precision Red Advanced Protein Assay Reagent（Cytoskeleton，Inc。，目录号：ADV02）（在室温下保存）
PIPES（Sigma-Aldrich公司，目录号：P1851）（在室温下储存）
EGTA（Fisher Scientific，目录号：O2783-100）（室温下保存）
氯化镁六水合物（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
来自Milli-Q ® Advantage A10净水系统（Millipore Sigma）的超纯水
TM alpha Tubulin抗体，单克隆抗体，因子（GenScript，目录号：A01410）（ - 20°C以下保存）
Pluronic F-127,100克（Anatrace，目录号：P305）（室温下储存）
Carl Zeiss Immersol TM 518 F Immersion Oil（Fisher Scientific，目录号：1262466A）（室温下储存）
PEM缓冲液（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）

设备

冰桶（Fisher Scientific，目录号：07210123）
Milli-Q ® Advantage A10净水系统（Millipore Sigma）
Sorvall离心机配备S120-AT2转子（Thermo Fisher Scientific，型号：Discovery）
37°C培养箱（Fisher Scientific，目录号：11690525D）
微量离心机仪（Eppendorf，型号：5424）
倒置荧光显微镜配备完美聚焦系统和100x / 1.49 NA物镜（尼康，型号：Ti-E）
激光发射系统，每线15 mW，波长为405/488/561/640 nm（尼康，型号：LUN4）
电子倍增CCD相机（Andor Technology，型号：iXon 888）
用于成像HiLyte Fluor 488或Alexa Fluor 488荧光的GFP滤光片立方体（Chroma Technology Corp.，目录号：49002）
用于成像罗丹明或TMR荧光的TRITC滤光片立方体（Chroma Technology Corp.，目录号：49008）
HP工作站，配备3.5 GHz 6核Xeon处理器，64 GB内存，1 TB硬盘和64位Windows 7（Micro Video Instruments，Inc。，目录号：99909）
Pipet-Lite LTS移液器L-20XLS +（Rainin Instrument，LLC，目录号：17014392）
Pipet-Lite LTS移液器L-200XLS +（Rainin Instrument，LLC，目录号：17014391）

软件

NIS-Elements高级研究（尼康）（ https：//www.nikoninstruments。 COM /产品/软件/ NIS元素 - 高级研究）
ImageJ（NIH， https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）
KaleidaGraph（ http://www.synergy.com/wordpress_650164087/kaleidagraph/ ）

程序

准备荧光标记的微管
1. 将未标记的猪微管蛋白（Cytoskeleton，Inc。）溶解在PEM缓冲液（配方1）中的冰上至终浓度为5 mg / ml（例如>，将200μlPEM缓冲液加入1 mg未标记的冻干液中微管蛋白）。
2. 将HiLyte Fluor 488或罗丹明标记的微管蛋白（Cytoskeleton，Inc。）溶解在PEM缓冲液中的冰上至终浓度为5 mg / ml（例如>，加入4μlPEM缓冲液至20μg荧光 - 标记的冻干微管蛋白）。
3. 将50μl未标记的微管蛋白与4μl荧光标记的微管蛋白混合在干净的1.7 ml微量离心管中。该步骤和后续步骤可以在正常室内光下进行。没有必要在黑暗中移液。
4. 将微管蛋白混合物在冰上孵育10分钟而不摇动。
5. 将微管蛋白混合物在298,000 x g >和4°C（在具有S120-AT2转子的Sorvall Discovery离心机中）离心10分钟以除去不需要的微管蛋白聚集体。在该步骤中离心后通常不能看到沉淀，因为冻干的微管蛋白通常在上述步骤A1和A2中完全溶解。
6. 将含有预先清除的微管蛋白的上清液转移到新的1.7ml微量离心管中。
7. 加入0.54μl的100mM GTP（，即>，最终GTP浓度为1mM）以聚合预先澄清的微管蛋白。使用L-200XLS +移液器上下移液三次，充分混合溶液。不要过度移液，因为移液三次足以混合溶液并引发微管蛋白亚基的聚合。
8. 将GTP /微管蛋白混合物在37°C培养箱中孵育20分钟，不要摇动。
9. 将管从37°C培养箱中取出并在Eppendorf 5424微量离心机中以21,130 x g >短暂旋转10秒，以沉淀微量离心管盖子中可能形成的任何冷凝物。接下来，加入0.27μl10mM紫杉醇（，>，最终紫杉醇浓度为50μM）并使用L-200XLS +移液管通过上下吸移三次充分混合。
10. 将微管蛋白/ GTP /紫杉醇混合物在37℃下孵育另外20分钟而不摇动。
11. 在室温下，在Eppendorf 5424微量离心机中将含有紫杉醇稳定的微管的管在20,156 x g >离心10分钟。该步骤将聚合的微管与游离的未聚合的微管蛋白分开。
12. 弃去上清液，将沉淀重悬于50μlPEM缓冲液和0.25μl10mM紫杉醇中。为避免剪切聚合的微管，使用L-200XLS +移液管和用剃刀刀片剃掉的移液管尖端上下移液轻轻重悬沉淀。
13. 一旦沉淀完全溶解，溶液中微管的浓度将为~50μM。或者，可以按照制造商的方案，通过Precision Red Advanced Protein Assay Reagent（Cytoskeleton，Inc。）测量和测定浓度。
14. 将微管在室温下避光保存（例如>，在抽屉中）。这种微管制剂在室温下可长达一个月。
组装成像室
1. 切割两片双面胶带，并使用过滤钳将其粘在干净的显微镜载玻片上，如视频1和图1A的第1部分所示。两片胶带应平行放置，并在显微镜载玻片中间相互间隔1.5毫米。无需特定程序清洁显微镜载玻片表面。
  
  视频1.准备用于显微镜的成像室。第1部分>，显示程序B的步骤1-3的视频剪辑。第2部分>，视频夹子显示如何将溶液吸移到成像室。第3部分>，一个视频片段，演示如何更换成像室中的溶液。为了实现可视化目的，在第2部分和第3部分的夹子中显示的示例中使用了掺有溴酚蓝的PEM缓冲液。
2. 轻轻地在两片双面胶带上面放一块干净的盖玻片。沿着双面胶带区域向下按压盖玻片，形成夹在盖玻片和显微镜载玻片（即>，成像室）之间的腔室条带，如图1B所示。在将显微镜载玻片压下之前，不需要对盖玻片表面进行特殊处理。
3. 翻转盖玻片/滑动组件，使盖玻片相对于显微镜载玻片位于底部。
4. 通过使用PEM缓冲液将 TM α微管蛋白抗体（GenScript）从500μg/ ml稀释至33.3μg/ ml来制备抗微管蛋白抗体溶液。将未使用的抗体溶液储存在4°C以备后用。
5. 将7μl抗微管蛋白抗体吸移到成像室中。通过使用L-20XLS +移液管从腔室的一侧以一定角度缓慢注射来向腔室填充抗体溶液（参见图1C）。另请参阅视频1的第2部分以了解该技术。考虑在仅使用PEM缓冲液的练习室上排练该步骤，因为抗微管蛋白抗体溶液可能在第一次尝试时不会流入腔室。
6. 通过在室温下孵育5分钟使抗微管蛋白抗体粘附到腔室。
7. 用阻断缓冲液替换成像室中的抗微管蛋白抗体溶液（配方2）。为此，将一片Kimwipe切成三角形，并将尖端固定在成像室的一侧。当Kimwipe将抗体溶液从室中抽出时，将7μl封闭缓冲液吸移到室的另一侧（参见图1D）。另请参阅视频1的第3部分，了解更换成像室中溶液的技术。
  
  图1.腔室组装。 A.将双面胶带粘贴到显微镜载玻片上。 B.将盖玻片盖在双面胶带上。 C.转动盖玻片并滑过。用抗微管蛋白抗体溶液填充腔室。 D.通过在另一侧用Kimwipe抽出而一边注入流入阻塞缓冲区。
8. 使封闭缓冲液在室温下孵育5分钟。
9. 通过使用PEM缓冲液将微管原液（如上文步骤A中所述制备）从50μM稀释至0.125μM来制备微管溶液。为避免剪切微管，在移液微管时使用切割的移液管尖端，如过程A的步骤12所述。
10. 用稀释的微管溶液替换成像室中的阻断缓冲液。与上述步骤B7类似，使用一片Kimwipe从一侧将阻塞缓冲液从腔室中抽出，同时将微管溶液吸移到另一侧的腔室中。
11. 通过在室温下孵育5分钟使微管附着于抗微管蛋白抗体。
12. 将腔室置于倒置荧光显微镜下进行成像。
可视化微管结合和交联
以下步骤要求实验者掌握少量用荧光探针纯化和标记的测试微管结合蛋白，该荧光探针不同于用于标记微管的荧光探针。我们将实验者转介到其他研究（Markus et al。>，2012; Zhu et al。>，2017），用于涉及用TMR纯化和标记HALO标记的融合蛋白的方案。或Alexa Fluor 488，适用于以下步骤。
1. 将10μl125nM紫杉醇稳定的微管（如方法A中所述用HiLyte Fluor 488标记）与1μl10μMMAP（用TMR标记）在PEM缓冲液中混合。加入9μlPEM缓冲液使总反应体积达到20μl。或者，在该步骤中，可以将用罗丹明标记的相同体积和浓度的紫杉醇稳定的微管（如方法A中所述制备）与用Alexa Fluor 488标记的MAP混合。与缓冲液单独混合的微管应作为对照单独进行。
2. 将混合物在室温下孵育10分钟。
3. 将微管/ MAP混合物流入已经用抗微管蛋白抗体和封闭缓冲液处理的成像室中（步骤B中的步骤1-8）。如过程B中步骤10所述，使用一片Kimwipe从一侧将阻塞缓冲液从腔室中抽出，同时将微管/ MAP溶液吸移到另一侧的腔室中。为避免剪切微管，在将微管移液到成像室时使用切割的移液管尖端。
4. 通过在室温下孵育5分钟使微管/ MAP附着于抗微管蛋白抗体。
5. 为了洗掉未附着的微管/ MAP，将新鲜的封闭缓冲液一次流入成像室。
6. 在室温下孵育5分钟。将腔室带到显微镜室进行成像。
7. 要观察微管/ MAP和微管/缓冲液样品，请使用配备Perfect Focus System和100x / 1.49 NA物镜的Nikon Ti-E倒置显微镜。
8. 将一滴浸油放在成像室的盖玻片侧，并将载玻片安装在显微镜载物台上。
9. 使用LUN4激光发射系统（尼康）照亮荧光团和iXon 888电子倍增CCD相机（安道尔技术），对荧光标记的微管和MAP进行成像。
10. 使用GFP滤光片立方体组（Chroma Technology Corp.）可视化Alexa Fluor 488或HiLyte Fluor 488荧光。使用TRITC滤光片立方体组（Chroma Technology Corp.）可视化罗丹明或TMR荧光。
11. 使微管相对于100x / 1.49 NA物镜聚焦。调整聚焦在GFP通道中，用于HiLyte Fluor 488标记的微管。或者，如果步骤C1使用罗丹明标记的微管，则使用TRITC通道。 HiLyte Fluor 488标记的微管图像的一个例子如图2所示。
  
  图2.HiLyte Fluor 488标记的微管的实例在该图中，在Nikon Ti-E倒置显微镜中观察成像室中与抗微管蛋白抗体结合的微管。比例尺=7μm。
12. 切换到TRITC通道以显示微管上的结合MAP。或者，如果步骤C1使用Alexa Fluor 488标记的MAP，则切换到GFP通道。
13. 要获取双色图片，请使用带有NIS-Elements软件（尼康）的PC工作站，该软件控制通道切换，激光强度和相机设置。图3显示了HiLyte Fluor 488标记的微管和TMR标记的MAP的双色图像示例。
  
  图3.荧光标记的微管和MAP的双色图像示例。 HiLyte Fluor 488标记的微管与TMR标记的重组MAP，She1-C-TMR混合，如Zhu et al。>（2017）所述纯化，在成像室中可视化在这幅图片中。比例尺=3.6μm。
14. 为了收集足够的数据用于后续分析，每个室捕获至少20个不同的双色微管/ MAP图像区域。用至少三种独立的MAP制剂重复实验。
15. 使用相同的相机设置来比较从腔室到腔室的微管结合的MAP量，或者当使用不同的MAP浓度时（如果需要）。
16. 一些MAP可能交联或捆绑微管。在存在和不存在MAP的情况下的图像微管以确定观察微管束的频率。通过测量微管横截面强度可以将束与单个微管区分开（如数据分析中所述）。

数据分析

要量化微管上结合MAP的相对量，请使用ImageJ软件（NIH）中的分段线工具。沿着双色图像中观察到的单个微管描绘一条线（如图4，左图所示）。测量至少50个单独微管的每单位长度MAP的平均荧光强度（参见图4）。通过将线条工具移动到没有微管的相邻区域来减去每个测量的背景（如图4，右图所示）。计算每单位长度校正平均强度的平均值。

图4.定量微管上结合MAP的实例。左>，沿着单个微管绘制的样本线（由1和3表示）。右>，通过ImageJ（在Analyze选项卡下）测量的每单位线长度的She1-C-TMR的平均强度。通过将线移动到没有微管的相邻区域（由2和4表示）来测量背景强度。
将存在MAP时测量的值与缓冲液控制中的值进行比较。使用KaleidaGraph软件绘制实验值与对照条件的值分布。执行双尾未配对Student's t > -test以确定两个分布之间的统计显着性。
为了确定微管是否通过MAP交联，使用ImageJ中的分段线工具在双色图像中观察到的各个微管结构上画一条线（如图5，左图所示）。使用ImageJ中的绘图轮廓工具测量沿线的横截面荧光强度（图5，中间面板）。对至少50种不同的微管结构进行这些测量。使用KaleidaGraph软件绘制荧光强度作为线的函数（参见Zhu 等人的图3C，>，2017用于样品图）。计算荧光分布的平均峰强度。
比较在MAP存在下观察到的微管结构的峰强度与仅缓冲液对照中的峰值强度（参见Zhu 等人的图3C，<2017;实施例中的图3C）。执行双尾未配对学生的 t > - 测试，以确定两组峰值强度之间的统计显着性。

图5.测量横截面荧光强度的示例。左>，穿过微管结构。中间>，沿线的荧光剖面。正确>，绘制个人资料的值。

笔记

由于成像室未密封，腔室中的液体将缓慢蒸发，从而改变样品浓度并影响图像质量。因此，每个成像室应仅在室温下成像约15分钟。
由于微管通过抗微管蛋白抗体附着在玻璃表面，因此捕获单焦平面图像应足以涵盖微管的整个厚度。

食谱

PEM缓冲液（100毫升）
2.42克PIPES
20.33mg MgCl 2 六水合物
38.04毫克EGTA
1毫升100毫摩尔GTP
超纯水
用0.1M NaOH调节pH至6.9
封闭缓冲液（100毫升）
1克Pluronic F-127
100毫升PEM缓冲液

致谢

这项工作得到了W.H的NIH / NIGMS拨款（GM076094）的支持。 L.

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

Gonczy，P.，Pichler，S.，Kirkham，M。和Hyman，A.A。（1999）。细胞质动力蛋白是MTOC定位的不同方面所必需的，包括中心体分离，在一个细胞阶段 Caenorhabditis elegans >胚胎。 J Cell Biol > 147（1）：135-150。＆nbsp;
Goshima，G。和Scholey，J。M.（2010）。控制有丝分裂纺锤体长度。 Annu Rev Cell Dev Biol > 26：21-57。
Howell，B.J.，McEwen，B.F.，Canman，J.C.，Hoffman，D.B.，Farrar，E.M.，Rieder，C.L。和Salmon，E.D。（2001）。细胞质动力蛋白/ dynactin驱动动粒蛋白转运至纺锤体极，并在有丝分裂纺锤体检查点失活中发挥作用。 J Cell Biol > 155（7）：1159-1172。
Khmelinskii，A.，Roostalu，J.，Roque，H.，Antony，C。和Schiebel，E。（2009）。纺锤体中区的磷酸化依赖性蛋白质相互作用介导细胞周期延长的细胞周期调节。 Dev Cell > 17（2）：244-256。
Markus，S。M.，Kalutkiewicz，K。A.和Lee，W。L.（2012）。 She1介导的沿着星形微管的动力蛋白运动抑制促进了纺锤体的极化运动。 Curr Biol > 22（23）：2221-2230。
Omer，S.，Greenberg，S。R.和Lee，W。L.（2018）。皮质动力蛋白牵拉机制受差异性靶向附着分子Num1调节。 Elife > 7：e 36745。
Rusan，N.M.，Tulu，U.S。，Fagerstrom，C。和Wadsworth，P。（2002）。前期/前中期微管阵列的重组需要细胞质动力蛋白依赖性微管转运。 J Cell Biol > 158（6）：997-1003。
Salina，D.，Bodoor，K.，Eckley，D.M.，Schroer，T.A.，Rattner，J.B。和Burke，B。（2002）。细胞质动力蛋白作为核膜破裂的促进因素。细胞 > 108（1）：97-107。
Schmidt，D.J.，Rose，D.J.，Saxton，W。M.和Strome，S。（2005）。快速作用的秀丽隐杆线虫中细胞质动力蛋白重链的功能分析>温度敏感突变。 Mol Biol Cell > 16（3）：1200-1212。
Sharp，D.J。，McDonald，K.L.，Brown，H.M.，Matthies，H.J。，Walczak，C.，Vale，R.D.，Mitchison，T.J。和Scholey，J.M。（1999）。双极驱动蛋白，KLP61F，交叉连接微球在 Drosophila的微极束内>胚胎有丝分裂纺锤体。 J Cell Biol > 144（1）：125-138。
Tanenbaum，M。E.，Macurek，L.，Galjart，N。和Medema，R。H.（2008）。 Dynein，Lis1和CLIP-170在双极纺锤体装配过程中抵消依赖Eg5的中心体分离。 EMBO J > 27（24）：3235-3245。
Wadsworth，P。和Khodjakov，A。（2004）。 E pluribus unum：朝向主轴装配的通用机构。趋势单元Biol > 14（8）：413-419。＆nbsp;
Wadsworth，P.，Lee，W。L.，Murata，T。和Baskin，T。I.（2011）。关于主题的变化：不同细胞中的纺锤体装配。 Protoplasma > 248（3）：439-446。＆nbsp;
Zhu，Y.，An，X.，Tomaszewski，A.，Hepler，P。K.和Lee，W。L.（2017）。 She1的微管交联活动可确保主轴定位的主轴稳定性。 J Cell Biol > 216：2759-2775。
Zulkipli，I.，Clark，J.，Hart，M.，Shrestha，RL，Gul，P.，Dang，D.，Kasichiwin，T.，Kujawiak，I.，Sastry，N。和Draviam，VM（2018）。人体细胞中的纺锤体旋转依赖于MARK2介导的赤道纺锤体定心机制。 J Cell Biol > 217（9）：3057-3070。