材料和试剂

移液器吸头（Labcon，1,250μl，目录号：1045-260-300;200μl，目录号：1030-260-300;10μl，目录号：1036-260-000）＆nbsp;
微量离心管1.7 ml（MultiMax，目录号：2942）
50毫升锥形离心管（Cellstar，目录号：227261）
比色皿9型石英10毫米路径（Starna，目录号：9Q10）
Vivaspin TM 2蛋白浓缩物旋转柱，MWCO 10,000 Da（GE Healthcare Life Sciences，目录号：28932247）
注射器过滤器，0.45μm（Ahlstrom，目录号：760506）＆nbsp;
带Luer-Lok尖端的注射器，20毫升（Becton Dickinson，目录号：3028360）＆nbsp;
10-15mg / ml纯化的耻垢分枝杆菌 MSMEG_5795，在20mM Tris-HCl pH 8.0和150mM NaCl（Mortuza 等人，2018）和20-40中。在50 mM Tris pH 8.0,250 mM NaCl和0.1 mM中纯化的炭疽芽孢杆菌谷氨酸消旋酶同工型2（MurI2 Ba ）蛋白质mg / ml DTT（May et al。，2007）
Tris base（NeoFroxx，目录号：1125KG001）
HCl，37％，试剂级，ACS（Scharlau，目录号：AC07412500）
α-酮戊二酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：K1875）
吡哆醛5'-磷酸盐水合物（PLP）（Sigma-Aldrich，目录号：P9255）
来自猪肌肉的L-乳酸脱氢酶（Roche，目录号：10107085001）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钾盐（NADH）（西格玛奥德里奇，目录号：N4505）
D-丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7377）
NaOH（ACS试剂等级，目录号：SO042500）＆nbsp;
N-环己基-2-氨基乙磺酸（CHES）（ACROS，目录号：208181000）
Iodonitrotetrazolium chloride（INT）（西格玛奥德里奇，目录号：I10406）
Diaphorase（西格玛奥德里奇，目录号：D5540）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD + ）（Sigma-Aldrich，目录号：N1511）
腺苷5'-二磷酸（ADP）（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
L-谷氨酸脱氢酶（LGDH）（西格玛奥德里奇，目录号：G2501）
Pierce TM Coomassie Plus（Bradford）检测试剂盒（Thermo Fisher，目录号：23236）
10 M NaOH（通过在ASTM I型（18MΩ）水中逐渐溶解NaOH颗粒制成，在室温下储存，无需消毒）

注意：以下所有溶液均采用ASTM I型（18MΩ）水制备，并在使用前通过0.45μm过滤器过滤。除非另有说明，否则溶液长期储存在4°C。

1 M Tris碱（用HCl调节溶液至pH 8.1）
0.5Mα-酮戊二酸＆nbsp;
2 mM PLP
10 mM NADH（为每次检测准备新溶液）
0.5 M D-丙氨酸
1 M CHES（用NaOH调节溶液至pH 9.2）＆nbsp;
D-氨基酸转氨酶反应部分混合物（见食谱）
谷氨酸反应部分混合物（见食谱）

设备

磁力搅拌棒15 mm x 6 mm（BRAND，目录号：137114）
Pipetman Neo ® Pipets（Gilson，型号：P1000N，目录号：F144566; P200N，目录号：F144565; P20N，目录号：F144563）＆nbsp;
25毫升玻璃烧杯（Boeco，目录号：BOE 5010614）
微量离心机（Eppendorf，型号：5415R）
磁力搅拌器（Barnstead Thermolyne，型号：SP131010-33）
Ultrospec TM 3100 pro紫外/可见分光光度计，带SWIFT II软件（GE Healthcare Life Sciences，型号：Ultrospec TM 3100 pro）
MultiTemp III（GE Healthcare）恒温循环器控制紫外 - 可见分光光度计比色皿的温度
-20°C冰柜

软件

Biochrom TM SWIFT II软件，版本2.05

程序

分析准备工作
1. 使用固定化金属亲和层析和尺寸排阻色谱纯化10-15 mg / ml MSMEG_5795和20-40 mg / ml MurI2 Ba 蛋白。
  注意：根据制造商的建议，使用Pierce TM Coomassie Plus（Bradford）Assay测定分枝杆菌蛋白质浓度。在4°C下将两种蛋白质以16,000 x g离心20分钟，以在分析前除去任何聚集物。
2. 准备所有用于分析的储备溶液（参见食谱）。
D-氨基酸转氨酶反应
1. 制备所需体积的含有100mM Tris-HCl pH8.1,10mMα-酮戊二酸，0.15mM PLP，5U L-乳酸脱氢酶，0.2mM NADH和77nM MSMEG_5795蛋白的D-AAT测定反应部分混合物。例如，20毫升是这里方便的量。如上所述，在进行测定之前，每天新鲜制备NADH。
  注意：在测定过程中将测定混合物保存在冰上并在使用前平衡至室温。
2. 将950μl反应混合物转移至1ml石英比色杯中，并在30℃下预孵育5分钟。
3. 测量340nm处的吸光度2分钟，以在Ultrospec TM 3100 pro上设置基线。＆nbsp;
4. 为了开始反应，向测定混合物中加入50μl0.5MD-丙氨酸底物至终浓度为25mM以开始反应并在30℃下孵育每个比色杯20,40和60分钟。吸光度应随时间降低。
5. 向阴性对照样品中加入50μl水代替底物，并在30℃下孵育60分钟。＆nbsp;
6. 孵育后，立即将比色皿转移至4°C以停止反应。＆nbsp;
7. 使用具有10,000Da MWCO的Vivaspin 2蛋白质浓缩器旋转柱过滤反应混合物以除去MSMEG_5795和L-乳酸脱氢酶。使用这种无蛋白质输出作为随后的谷氨酸消旋酶（MurI）活性测定的底物。
  注意：在进行第二次偶联酶测定或进行进一步分析之前，样品可以在-20°C下储存。
谷氨酸消旋酶反应
1. 制备所需体积的MurI测定反应部分混合物，其含有50mM CHES pH 9.2,5mM NAD + ，37.5U ml -1 L-谷氨酸脱氢酶，2.5mM ADP，0.65 mM INT，2 U ml -1 心肌黄酶。例如，10毫升是这里方便的量。
  注意：在玻璃烧杯中剧烈混合测定组分，但使用小搅拌棒和磁力搅拌器避免发泡。用0.45μm注射器过滤器和带有Luer-Lok尖端的20ml注射器过滤混合物。在测定期间将溶液保持在冰上。使用前平衡至室温。这种解决方案将采用淡淡的鲑鱼色调。
2. 对于每个反应样品，将875μl反应混合物转移到1 ml石英比色皿中。＆nbsp;
3. 将来自D-AAT测定的100μl产物加入每个比色杯中。＆nbsp;
4. 通过添加25μlMurI2 Ba 至最终酶浓度为10μM开始反应。＆nbsp;
5. 在空白样品中，添加用于MurI2 Ba 原液的缓冲液代替MurI2 Ba 并添加水代替基质。＆nbsp;
6. 在阴性对照样品中加入水而不是底物。＆nbsp;
7. 在30℃下监测500nm处的吸光度30分钟。
  注意：从每次测量中减去从空白样品中获得的吸光度值，以获得最终的吸光度值。

数据分析

将D-AAT测定的产物作为谷氨酸消旋酶测定的输入，通过监测500nm处的吸光度增加来确认谷氨酸的存在。 20,40和60分钟样品的吸光度值的增加对应于谷氨酸产生随时间的预期增加（图1）。这里报道的谷氨酸检测是定性的。从分析输出的高分辨率质谱法获得的数据也支持该结果，其显示在分别孵育20,40和60分钟的样品中谷氨酸浓度增加0.3,0.7和1.0mM。结果，可以使用谷氨酸消旋酶测定评估MSEMG_5795酶将D-丙氨酸转化为D-谷氨酸的能力。

图1.通过谷氨酸消旋酶测定验证MSMEG_5795的时间依赖性谷氨酸产生（参见步骤C7）。来自D-AAT测定的无蛋白产物用作D-L方向的谷氨酸消旋酶测定的底物。在500nm处观察到吸光度的增加30分钟。每个样品一式两份并含有100μl底物和10μM谷氨酸消旋酶。从每次测量中减去空白样品，并在绘制时间之前平均吸光度值。从20,40和60分钟样品获得的吸光度值分别以绿色，蓝色和红色显示。含有水而不是底物的对照样品显示为黑色。图1最初发表于Mortuza et al。，2018。（该图经分子微生物学许可转载。）

笔记

测定混合物中列出的组分浓度代表在测定开始时所需的浓度，但一定要考虑加入随后加入的酶或其他物质可能导致的任何稀释。
如果担心在该测定中可能由第一种酶产生L-谷氨酸，则可以加入另外的对照，其中使用酶L-谷氨酸脱氢酶直接测定第一种酶的输出而不与MurI孵育。＆NBSP;
其他在30°C和pH 9.2下具有足够活性的谷氨酸消旋酶也可能在这里起作用，但我们只用MurI2 Ba 酶试验了这种测定。 />

食谱

D-氨基酸转氨酶反应部分混合物
100mM Tris-HCl，pH 8.1
10mMα-酮戊二酸
0.15 mM PLP
5 U乳酸脱氢酶
0.2 mM NADH
77 nM MSMEG_5795蛋白质
用ASTM I型（18MΩ）水制备
使用前通过0.45μm过滤器过滤
不建议长期存放。每天准备新鲜
稍后添加底物
谷氨酸反应部分混合物
50 mM CHES，pH 9.2
5 mM NAD +
37.5U ml -1 L-谷氨酸脱氢酶
2.5 mM ADP
0.65 mM碘硝基四唑氯化物
2 U ml -1 心肌黄酶
用ASTM I型（18MΩ）水制备
使用前通过0.45μm过滤器过滤
不建议长期存放。每天准备新鲜
Substrate和MurI稍后加入

致谢

该方案首先在Mortuza 等人的文章中简要描述（2018）。该研究得到了新西兰彩票健康研究-LHR2017-48905，奥塔哥大学，莫斯科威尔金斯中心 - 奥克兰大学和德克萨斯州休斯顿的Thrash基金会的支持。

利益争夺

作者没有冲突要宣布。

参考

Gallo，K。A.和Knowles，J.R。（1993）。来自 Lactobacillus 的谷氨酸消旋酶的纯化，克隆和辅因子独立性。< / a> 生物化学 32（15）：3981-3990。
May，M.，Mehboob，S.，Mulhearn，D.C.，Wang，Z.，Yu，H.，Thatcher，G.R.，Santarsiero，B.D.，Johnson，M.E。和Mesecar，A.D。（2007）。来自炭疽芽孢杆菌的两种谷氨酸消旋酶同工酶的结构和功能分析及其影响抑制剂设计。 J Mol Biol 371（5）：1219-1237。
Mortuza，R.，Aung，H.L.，Taiaroa，G.，Opel-Reading，H.K.，Kleffmann，T.，Cook，G.M。和Krause，K.L。（2018）。耻垢分枝杆菌补体中新鉴定的D-氨基酸转氨酶的过表达谷氨酸消旋酶缺失。 Mol Microbiol 107（2）：198-213。
Poen，S.，Nakatani，Y.，Opel-Reading，H.K.，Lasse，M.，Dobson，R。C. and Krause，K.L。（2016）。 E 探索结核分枝杆菌的谷氨酸消旋酶结构作为模板抗分枝杆菌药物的发现。 Biochem J 473（9）：1267-1280。
Tanizawa，K.，Masu，Y.，Asano，S.，Tanaka，H。和Soda，K。（1987）。来自嗜热菌的D-氨基酸氨基转移酶，YM-1：酶学特性，克隆氨基酸序列。在：第七届国际化学和生物学方面的维生素B6催化。在：Korpela，T。和Christen，P。（编辑）。芬兰图尔库Birkhauser Verlag：43-46。