材料和试剂

吸水棉
1毫升注射器（Terumo，目录号：SS-01T）
26 G针（Terumo，目录号：NN-2613S）
微型载玻片（Matsunami，目录号：S-2226）
细胞过滤器（Thermo，目录号：08-771-2）
细胞系
1. B300-19细胞
  IL-9R / B300-19和EV / B300-19细胞：B300-19细胞（小鼠前B细胞系），用含有 Il9r cDNA的逆转录病毒载体转导（pMXs-IL9R-IRES） -hNGFR）或空载体（EV; pMXs-IRES-hNGFR）。 B300-19细胞系由Takashi Nakayama博士提供。我们生成的逆转录病毒载体和B300-19转染子可根据要求提供。＆nbsp;
2. Plat-E细胞
  Plat-E细胞系和原始pMXs载体由Toshio Kitamura博士提供。
Lew / SSN大鼠（雌性Lew / SSN大鼠购自Sankyo Lab Service。大鼠在4周龄时免疫）
脱毛膏（一般商品化产品）
戊巴比妥钠（Kyoritsu Seiyaku，Somnopentyl Injection）
QIAGEN Plasmid Giga Kit（QIAGEN，目录号：12191）
Fugene HD（Promega，目录号：E2311）
FITC-缀合的二抗[FITC-缀合的山羊抗大鼠IgG（H + L）]（SouthernBiotech，目录号：3050）
FITC-anti-IgG1（BD Bioscience，目录号：562580）
PE-anti-CD138（Biolegend，目录号：142503）
PE-anti-IgM（Thermo，目录号：12-5790-81）
PE-anti-IgD（Biolegend，目录号：405705）
PerCP / Cy5.5-抗T和-B细胞活化抗原克隆GL-7（Biolegend，目录号：144609）
PE / Cy7-anti-CD38（Thermo，目录号：25-0381-80）
APC / Cy7-anti-B220（Biolegend，目录号：103223）
生物素-NP 14 -BSA（内部）
Brilliant Violet 421 Streptavidin（Biolegend，目录号：405226）
MEM培养基（Thermo，目录号：11095080）
透明质酸酶（Sigma，目录号：H3631-30KU）
70％（v / v）乙醇
磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）
三
EDTA
叠氮化钠
透明质酸酶解决方案（见食谱）
Tris-EDTA缓冲液（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
质粒DNA溶液（见食谱）

设备

Electroporator（BTX，Electro Square Porator ECM830，图1A）
带IC挂钩的铜线（Toyoshima，定制或一般商品化产品，长度：超过一米，图1A-1B）
26 G两级针（Toyoshima，定制，图1C-1D）
伽玛辐照装置（加拿大原子能有限公司，Gammacell 40）
BD FACS Calibur
BD FACS CantoII

图1. DNA免疫实验设备的详细信息。 A. Electroporator。 B.带IC挂钩的电极和铜电缆。 C.带有26 G两级针的1 ml注射器。 D. 26 G两级针。

软件

FlowJo（Tree Star， https://www.flowjo.com ）

程序

准备并安装电穿孔器（图1A）：
电压：100 V
脉冲长度：50 ms
脉冲数：6（间隔1秒）
周期：1 kHz。
用24-36mg / kg戊巴比妥钠麻醉大鼠。（持续时间：30-60分钟）
脱毛后肢用脱毛膏（乳膏应停留约3分钟）（图2A）。
使用浸渍有70％（v / v）乙醇的脱脂棉对后肢进行消毒。
使用具有26G两阶段针的1ml注射器将50μl透明质酸酶溶液注射到股四头肌中（图2B）。
静置10分钟。＆nbsp;
将电极刺入股四头肌（图1B和2C）。
将30μl质粒DNA溶液注入透明质酸酶溶液预处理的相同位置（图2D）。
通过电穿孔仪脉冲（100 V，50 ms脉冲长度，1 kHz，每1 s间隔6次）。
重复相同的操作（步骤3-9）到另一个后肢（图2A-2D）。
注意：所需的操作时间（步骤3-10）约为20分钟。

图2.使用体内电穿孔进行DNA免疫的实验程序。 A.脱毛后肢。 B.将透明质酸酶溶液注入股四头肌，静置10分钟。 C.将电极刺入股四头肌。 D.将质粒DNA溶液注射到进行透明质酸酶溶液预处理的相同位置。随后，通过电穿孔仪脉冲。对另一个后肢重复相同的操作（A-D）。
分别在初次免疫后1,3,4,7和9周重复相同的DNA免疫方案（图3）。

图3.使用大鼠进行DNA免疫的概述。使用体内电穿孔进行DNA免疫的方案。
使用γ辐照装置在PBS（优选在冰上）中照射（30Gy）1×10 9 IL-9R / B300-19细胞。
在最后一次免疫后4-27周，腹膜内转移1×10 9个照射的IL-9R / B300-19细胞。
在初次免疫后6或11周，使用IL-9R / B300-19细胞通过流式细胞术检查免疫大鼠的血清中的抗IL-9R IgG。用1:10 4 或更多稀释的血清进行检测是合乎需要的（图4A）。
为了产生产生单克隆抗体的杂交瘤，在细胞转移后3天从免疫大鼠中收集脾细胞，并通过常规方法将它们与小鼠骨髓瘤细胞系（例如，SP2 / 0）融合（例如，Köhler和Milstein，1975）。
使用流式细胞术筛选杂交瘤分泌IgG Ab，其染色IL-9R / B300-19细胞（并且不染色EV / B300-19细胞）（图4B）。

图4.抗血清和杂交瘤筛选的滴定。 A.使用流式细胞术滴定抗IL9R抗血清。 IL-9R / B300-19细胞用血清染色，如所示稀释（稀释）大鼠，6周前免疫。 B.杂交瘤筛选中的流式细胞术分析的实例。用杂交瘤上清液染色IL-9R / B300-19或EV / B300-19细胞。（A-B）结合的IgG用FITC-缀合的抗大鼠IgG Ab显示。
用抗小鼠IL-9R染色表达IL-9R的细胞（例如，图5）（Takatsuka et al。，2018）。

图5.检测记忆B细胞上的IL-9R表达。使用抗IL-9R mAb，RZ-103（右图）对NP特异性IgG1进行IL-9R表达的流式细胞术分析 + Il9r + / + 中脾脏中的记忆B细胞（门控策略显示在左侧）或 Il9r - / - ＆nbsp; 小鼠ip免疫16周前在明矾中与鸡γ球蛋白（NP-CGG）结合的半抗原NP。

数据分析

流式细胞术分析：用于分析，收集＆gt; 5,000个事件（图4）或＆gt;每个样本5,000,000个事件（图5）。从分析中排除死细胞和细胞碎片。通过向前和侧向散射在淋巴细胞门中定义单线态细胞。这些细胞可以通过荧光标记的抗体显现。（例如，图5：流式细胞术测定的分析通过FlowJo完成。）

笔记

逆转录病毒转导
1. 通过Fugene HD将pMXs-IL9R-IRES-hNGFR载体转染到Plat-E细胞中。
2. 转染后两天，收获含有病毒的上清液并加入B300-19细胞中。
血清的制备
1. 使用手术刀切断大鼠的尾巴并收集外周血（50-100μl）。
2. 将外周血静置在4°C，过夜。
3. 将外周血以2,500 x g ，4℃离心10分钟。
4. 收集血清（20-40μl）并储存在-20°C。
从脾脏制备单细胞悬液
1. 通过MEM培养基中的载玻片的磨砂玻璃部分研磨脾脏。
2. 通过细胞过滤器过滤脾细胞。
使用流式细胞仪检测血清滴度
1. 用FACS缓冲液稀释血清，并加入5×10 4个 IL-9R / B300-19细胞。
2. 离开冰上20分钟。
3. 用200μlFACS缓冲液洗涤两次。
4. 添加到FITC缀合的二抗。
5. 离开冰上20分钟。
6. 用200μlFACS缓冲液洗涤两次。
7. 转到流式细胞仪分析（参见数据分析）。
使用流式细胞术进行杂交瘤筛查
1. 收集培养物上清液（25-50μl）的杂交瘤并加入5×10 4个载体IL-9R / B300-19细胞。
2. 离开冰上20分钟。
3. 用200μlFACS缓冲液洗涤两次。
4. 添加到FITC缀合的二抗。
5. 离开冰上20分钟。
6. 用200μlFACS缓冲液洗涤两次。
7. 转到流式细胞仪分析（参见数据分析）。

食谱

透明质酸酶解决方案
在磷酸盐缓冲盐水中制备1单位/μl牛透明质酸酶溶液
Tris-EDTA缓冲区
10 mM Tris，pH 7.5
1 mM EDTA
FACS缓冲区
PBS（ - ）
0.5％BSA
2 mM EDTA
0.05％叠氮化钠
质粒DNA解决方案
如前所述，制备含有编码IL-9R-GroEL融合蛋白的基因的质粒的10mg / ml DNA溶液（在Tris-EDTA缓冲液中），由CAG启动子驱动（Fujimoto et al。>，2009）

致谢

我们感谢Y. Takatsuka的人物准备; K. Sano校对。这项工作得到了日本科学促进会KAKENHI，科学研究资助（B）（16H05206）和创新领域科学研究资助（25111512）的支持。

利益争夺

所有作者都声明他们没有竞争利益。

伦理

将Lew / SSN大鼠维持在东京理科大学生物医学科学研究所的动物设施中，在无特定病原体条件下，并在东京理科大学动物护理和使用委员会批准的方案下进行处理。

参考

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