材料和试剂

无菌DNase / RNase移液器吸头10μl，200μl，1,000μl（Labselect，目录号：T-001-10，T-001-200，T-001-1000）
从E8.5，E9.5和E10.5阶段的怀孕小鼠收集的胚胎。此处使用的小鼠品系已在先前描述过（Shen et al。，2017）
多聚甲醛（PFA）（Sigma，目录号：P6148）
Nonidet P-40（NP-40）（Sangon Biotech，目录号：A510110）
脱氧胆酸钠（西格玛，目录号：D6750）
X-gal（Gold Bio，目录号：X4281C）
K 3 Fe（CN） 6 （Sigma，目录号：244023）
K 4 Fe（CN） 6 （Sigma，目录号：P3289）
MgCl 2 （Sigma，目录号：M8266）
EGTA（Sigma，目录号：E3889）
IGEPAL（Sigma，目录号：I8896）
Salmon-gal（S-gal）（Lab Scientific，目录号：X668）
Tetranitro Blue Tetrazolium（TNBT）（VWR，目录号：TCT0250）
NaCl（Sigma，目录号：S7653）
KCl（Sigma，目录号：P9333）
Na 2 HPO 4 （Sigma，目录号：S7907）
KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：P5655）
NaH 2 PO 4 （Sigma，目录号：S9638）
PBS（见食谱）
4％PFA（见食谱）
0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.3）（见食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
染色缓冲液1（见食谱）
染色缓冲液2（见食谱）

设备

移液器（Gilson，目录号：F144801，F123600，F144058M，F123602）
6孔板（NUNC，目录号：140675）
加湿室（例如带盖的冰盒或带湿纸塔的泡沫箱）
解剖钳（精细科学工具，型号：Dumont＃5）
立体显微镜（徕卡，型号：MZ12.5）
轨道振动筛（MIULAB，GS-20）
微生物培养箱（Thermo Scientific，PR305225G）
显微镜（Leica，DFC340 FX数字火线相机系统）

软件

Leica Application Suite V3.7（Leica DFC340 FX数字FireWire相机系统的图像获取软件）

程序

如先前报道（Shea和Geijsen，2007）从怀孕小鼠收集胚胎，并在室温下将胚胎在10孔4％PFA（配方2）中固定在6孔板中（此处和以下步骤中使用的体积为一个胚胎）。 6孔板应放置在加湿室中，保持在设定为65rpm的轨道振荡器上。固定时间不同，取决于胚胎的发育阶段。下表列出了建议的固定时间。
使用镊子将胚胎转移到装有10ml洗涤缓冲液的6孔板的新孔中（配方4）。每次洗涤，在室温下孵育胚胎10分钟洗涤三次。在洗涤步骤期间，6孔板应放置在设定为65rpm的轨道振荡器上的加湿室中。
使用镊子将胚胎转移到装有10ml染色缓冲液1（配方5）的6孔板的新孔中。在微生物培养箱中37°C孵育过夜（记住保护样品免受光照）。 6孔板应放置在加湿室中。
使用镊子将胚胎转移到装有10ml洗涤缓冲液的6孔板的新孔中，并在室温下孵育10分钟。接下来使用镊子将胚胎用染色缓冲液2（配方6）转移到6孔板的新孔中，并在37℃下在微生物培养箱中孵育。 6孔板应放置在加湿室中。应使用立体显微镜密切监测染色，直至出现特异性染色。染色时间可能从几分钟到一小时不等。＆nbsp;
使用镊子将胚胎转移到装有10ml洗涤缓冲液的6孔板的新孔中并洗涤三次。孵育每次洗涤10分钟。在洗涤过程中，6孔板应置于加湿室中，在设定为65rpm的轨道振荡器上。清洗胚胎后，可将其直接成像或在4°C的洗涤缓冲液中保存一周。＆nbsp;
在Leica DFC340 FX显微镜上使用Leica Application Suite V3.7拍摄图像。我们在Leica Application Suite V3.7中使用Z-stack选项，因为染色的胚胎相对较厚。从Z-堆叠处理生成的图像用作最终结果。不表达 LacZ 基因的胚胎用作阴性对照。图2显示了X-gal / FeCN，S-gal / TNBT的代表性染色图像，以及此处描述的改进方法。

图2. X-gal / FeCN，S-gal / TNBT的代表性 LacZ 染色图像，以及检测E10.5胚胎中miR-322 / -503表达的改进方法。 A.用X-gal / FeCN法染色的胚胎。 B.用S-gal / TNBT方法染色的胚胎。 C.用本文所述的改进方法染色的胚胎。用Leica DFC340 FX显微镜以10x放大率拍摄图像。

数据分析

将指向特定染色区域的比例尺，注释和箭头添加到胚胎图像中。

食谱

PBS
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4
在蒸馏水中，pH = 7.4
4％PFA
将4％PFA溶解在PBS中
在50°C加热并涡旋直至完全溶解然后将pH调节至7.2~7.4
0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.3）
23％NaH 2 PO 4 溶液（0.2M NaH 2 PO 4 在蒸馏水中）
77％Na 2 HPO 4 溶液（0.2M Na 2 HPO 4 在蒸馏水中）
洗涤缓冲液
0.02％NP-40
PBS中的0.01％脱氧胆酸钠
染色缓冲液1
5mM K 3 Fe（CN） 6
5mM K 4 Fe（CN） 6
0.02％NP-40
0.01％脱氧胆酸盐
2 mM MgCl 2
5 mM EGTA
PBS中1mg / ml X-gal
染色缓冲液2
1毫克/毫升S-gal
0.4 mM TNBT
0.1％脱氧胆酸钠
0.2％IGEPAL
在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中的2mM MgCl 2，

致谢

我们感谢休斯顿大学的魏宇在动物经营方面提供指导;文静宝在辽宁中医药大学获得技术支持。国家自然科学基金（No. 31701289），安徽省自然科学基金（No. 1808085QH234），安徽省教育委员会（No. KJ2017A319），高等学历人才高等基金资助项目安徽省教育与安徽师范大学创业基金。

利益争夺

所有与动物有关的工作均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

参考

Bonnerot，C。和Nicolas，J.F。（1993）。将 LacZ 基因融合应用于植入后发育。 Methods Enzymol 225：451-469。
Gugliotta，P.，Pacchioni，D。和Bussolati，G。（1992）。免疫细胞化学和原位杂交中β-半乳糖苷酶的染色反应。< / a> Eur J Histochem 36（2）：143-148。
Lojda，Z。（1970）。糖苷酶的靛蓝方法。 I.改进的β-D-葡萄糖苷酶方法及其在肠和肾酶定位研究中的应用。 Histochemie 22（4）：347-361。
Pearson，B.，Wolf，P。L.和Vazquez，J。（1963）。对一系列新的吲哚基化合物进行比较研究，以定位组织中的β-半乳糖苷酶。 Lab Invest 12：1249-1259。
Shea，K。和Geijsen，N。（2007）。解剖6.5 dpc小鼠胚胎。 J Vis Exp （2）：160。
Shen，X.，Bao，W.，Yu，W.，Liang，R.，Nguyen，B。和Liu，Y。（2017）。一种改进的方法，具有高灵敏度和低背景，可检测小鼠胚胎中低β-半乳糖苷酶的表达。 / a> PLoS One 12（5）：e0176915。
Stevens，M.E.，Meneses，J.J。和Pedersen，R.A。（1989）。小鼠金属硫蛋白 - 大肠杆菌β-半乳糖苷酶融合基因的表达（早期小鼠胚胎中的MT-βgal。 Exp Cell Res 183（2）：319-325。
Sundararajan，S.，Wakamiya，M.，Behringer，R。R.和Rivera-Perez，J.A。（2012）。快速，灵敏的小鼠胚胎β-半乳糖苷酶检测方法。发展 139（23）：4484-4490。