材料和试剂

1.5毫升螺旋盖微管（SARSTEDT，目录号：72.703.600）
5毫升螺旋盖管（SARSTEDT，目录号：60.9921.524）
27 Gx½“1 ml胰岛素注射器（Terumo，目录号：SS * 10M2713A）
26 Gx½“针（Terumo，目录号：NN + 2613R）
23 Gx1¼“针（Terumo，目录号：NN * 2332R）
3毫升注射器（Terumo，目录号：SS + 03L）
5毫升注射器（Terumo，目录号：SS + 05L）
80μm注射器过滤器（Sartorius，Minisart ®，目录号：16592）
45μm注射器过滤器（Sartorius，Minisart ®，目录号：16555）
96孔微孔板（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM MicroWell TM ，目录号：260860）
棉毛卷（BNS Medical，目录号：71841-14）
记号笔
铝箔
10周大（动物资源中心，澳大利亚默多克）
血清样品来源于卵清蛋白致敏的鼠模型
伊文思蓝（Sigma-Aldrich，目录号：E2129-10G），在室温下储存
卵清蛋白（OVA）冻干粉（Sigma-Aldrich，目录号：A5503），储存于4°C
用于灌溉的无菌水（Baxter，目录号：2F7114），在室温下储存
无菌注射用水（辉瑞，目录号：25020010），储存温度低于25°C
水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：23100-250G）
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（内部制造）
局部眼用软膏（诺华，Viscotears ®，目录号：1AD031591）
戊巴比妥钠（Virbac，Lethabarb ®，目录号：LETH-1）
异氟醚（Henry Schein，IsoThesia ®，目录号：988-3244），在黑暗中储存在25°C以下
5.71％水合氯醛溶液（C 2 H 3 Cl 3 O 2 ）（见食谱）
1％伊文思蓝染料储备液（见食谱）
10 mg / ml卵白蛋白原液（见食谱）
1：1一只大鼠的卵清蛋白 - 伊文思蓝染料溶液（见食谱）

设备

100毫升Schott瓶（Sigma-Aldrich，Duran ®，目录号：Z305170）
500毫升瓶顶过滤器，0.2微米孔径（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ® Rapid-Flow TM ，目录号：595-4520）
动物理发推子（Wahl，KM Cordless TM ，目录号：WA-9596-212）
保温垫（Kent Scientific Corporation，目录号：DCT-25）
小动物麻醉系统（Kent Scientific Corporation，SumnoSuite ®，目录号：SS-01）
4°C冰箱
-20°C冰柜

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件，版本7.0a）

程序

连续1对2稀释的血清样品
1. 使用96孔微量培养板，在PBS中进行连续1对2稀释的血清，最终样品体积为55μl。
  注意：
  1. 血清样品获自OVA致敏和气溶胶攻击的鼠模型。
  2. 最终血清稀释液包括：纯净，1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64和1：128样品。
  3. 重复55μl仅PBS样品作为阴性对照。
2. 除了重复的阴性对照样品外，每只大鼠可以分析总共8个单独的实验样品。
雄性Sprague Dawley大鼠麻醉
1. 将雄性Sprague Dawley大鼠置于麻醉诱导室中并通过异氟烷麻醉约3分钟。
2. 一旦充分麻醉，使用23 Gx1¼“针头和5 ml注射器腹腔注射雄性Sprague Dawley大鼠4 ml 5.71％水合氯醛溶液。
  注意：
  1. 该5.71％水合氯醛溶液将麻醉成年雄性Sprague Dawley大鼠（> 10周龄）约1小时。
  2. 雄性Sprague Dawley大鼠已经达到足够的深度平面麻醉，当踩踏撤退反射不存在或几乎不可察觉时。
3. 在麻醉的大鼠的眼睛上放置少量局部眼用软膏，以防止它们在手术过程中变干。
皮下注射血清稀释液
1. 将麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠置于保温垫上，并将大鼠的整个背部从颈部基部到臀部紧密剃毛。
2. 使用记号笔，标记覆盖整个大鼠背部的8 x 8点网格。将点间隔大约1厘米（图1）。
  注意：
  1. 不要使用蓝色标记，因为这很难与埃文斯蓝色染料区分开来。＆nbsp;
  2. 成年雄性Sprague Dawley大鼠将适合大约8个单独的血清样本。
  3. 在8 x 8样本网格下方包含2个额外的点，用于复制阴性对照样本。
3. 从最高稀释度（1：128）开始，使用27 G x 1/2“1 ml胰岛素注射器在第一个标记点下皮下注射50μl样品。继续向下注入每个连续稀释液的第一排点。
  注意：如果用右手注射，从大鼠右侧开始注射。当您向后穿过时，这将避免干扰注射部位（图1）。
4. 按照步骤C3，皮下注射剩余的7个单独样品和重复的PBS阴性对照样品。
  注意：每个样品都要使用新的无菌注射器。
5. 一旦注射完所有样品，用棉花卷覆盖大鼠背部并放回到外壳笼中。
6. 定期监测麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠，直至恢复全意识。
  
  图1.在程序C中执行的步骤的代表性图
伊文思蓝染料静脉注射
1. 皮下注射血清样品后24小时，按照方法B重新麻醉大鼠。
2. 将麻醉的大鼠放在其背部，并使用26 G x 1/2“针头和3 ml注射器静脉注射2 ml 1：1 OVA-Evans蓝色染料溶液（参见食谱）到阴茎静脉。
3. 将大鼠放在胃上，让样品孵育15-30分钟。
4. 注射后，OVA特异性IgE阳性的皮下血清样品将呈蓝色（图2）。记录每个血清样本的最高稀释度，返回阳性指示。
5. 记录完所有数据后，使用27 Gx½“1 ml注射器静脉注射600μlLethabarb®戊巴比妥钠，雄性安乐死雄性Sprague Dawley大鼠。
  
  图2.伊文思蓝检测染料的外渗，表明血清样本中存在OVA特异性IgE。静脉注射含有OVA特异性IgE的血清样品的连续稀释液将变为蓝色。 OVA-Evans蓝色染料溶液。记录每个样品中蓝色注射部位的最高稀释度（即，样品2的1：4稀释度）。

数据分析

在log 2 刻度上绘制数据以考虑序列稀释（即，neat = 1,1：2 = 2,1：4 = 3,1：8 = 4,1：16 = 5,1：32 = 6,1：64 = 7,1：128 = 8）使用GraphPad prism等图形程序。根据实验组的数量，可以通过学生的 t - 测试或单向ANOVA确定统计学显着性。正如在研究BALB / c小鼠的原始研究文章（Mincham et al。，2018;图1A）中所详述，通过在我们的实验室内进行的研究Brown Norway大鼠的另外研究（Leffler et al。，2018）和下图3比较早期OVA致敏和气溶胶攻击后的性别特异性反应（方案ID：1802387），OVA致敏和气溶胶攻击动物的OVA特异性血清IgE滴度显着高于天真的控制动物。

图3.早期生活中增强的血清OVA特异性IgE滴度OVA致敏和气溶胶攻击BALB / c小鼠。通过被动皮肤过敏试验测量的男性和女性血清OVA特异性IgE滴度的比较。数据来自个体动物，比较PBS对照与OVA致敏和气溶胶攻击的雄性（阴影）和雌性（白色）BALB / c小鼠，并显示为显示最小至最大n≥6个独立实验的框和须图。使用Student's t -test确定统计显着性，并表示为** P ＆lt; 0.01，**** P ＆lt; 0.0001。

食谱

5.71％水合氯醛溶液（C 2 H 3 Cl 3 O 2
1. 将5.71g水合氯醛溶于100ml无菌水中，在室温下注射
2. 用铝箔盖上（100毫升Schott瓶）以防光照并在4°C下储存
1％伊文思蓝染料储备液
1. 将1克伊文思蓝粉末溶于100毫升PBS中
2. 储存在4°C
10mg / ml卵清蛋白原液
1. 将1g OVA冻干粉末溶于100ml无菌水中，通过将冻干的OVA粉末置于水表面上并在室温下缓慢溶解而不搅拌溶液
2. 溶解后，使用500 ml瓶顶过滤器将10 mg / ml卵清蛋白溶液过滤到无菌的100 ml Schott瓶中
3. 将无菌10 mg / ml OVA储备液分装到1 ml等分试样（1.5 ml螺帽微管）中
4. 储存在-20°C
1：1一只大鼠的卵清蛋白 - 伊文思蓝染料溶液
1. 向600μlPBS中加入400μl10mg / ml OVA储备液，使最终浓度为4 mg / ml OVA溶液，总体积为1 ml
2. 将1ml 1％伊文思蓝染料加入1ml 4mg / ml OVA溶液中注意：在使用之前，通过80μm和45μm注射器过滤器过滤必要体积的1％伊文思蓝染料储备溶液，以去除沉淀。
3. 储存在4°C直至需要
  注意：在麻醉雄性Sprague Dawley大鼠之前立即补充1：1 OVA-Evans蓝色染料溶液。

致谢

作者要感谢Telethon Kids Institute Bioresources工厂的动物技术人员。利用该协议的原始研究文章（Mincham et al。，2018）由澳大利亚国家健康与医学研究委员会资助。

利益争夺

作者声明与此工作无关的财务或非财务竞争利益。

伦理

与该协议相关的所有动物实验均由Telethon Kids Institute动物伦理委员会正式批准，该委员会根据澳大利亚国家健康与医学研究委员会制定的关于科学研究中动物护理和使用的指南进行操作。

参考

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Mincham，K.T.，Scott，N.M.，Lauzon-Joset，J.F.，Leffler，J.，Larcombe，A.N.，Stumbles，P.A.，Robertson，S.A.，Pasquali，C.，Holt，P.G。和Strickland，D.H。（2018）。用细菌衍生的药物进行经胎盘免疫调节可预防过敏性气道炎症。 J Clin Invest 128（11）：4856-4869。
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