材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有存储都处于室温下。

QIAcube HT Plasticware（QIAGEN，产品目录号：950067）
粘合剂PCR板密封（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号：AB0558）
无菌酒精预制垫（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：22-363-750）
15 ml离心管（Corning，目录号：430766）
96孔紫外透明微孔板（康宁，目录号：3635）
384孔qPCR板（Thermo Fisher，Applied BioSystems，目录号：4309849）＆nbsp;
定制SOD1 MGB探针和引物（Thermo Fisher，Custom Genomics，-20°C）
1. 探针：SOD1HumanV2-55T（VIC-ACTCTCTCCAACTTTG），具有VIC荧光报告化学，6000 pmole（湿，脱盐）＆nbsp;
2. 正向引物：SOD1HumanV2-27F（GTAAATCAGCTGTTTTCTTTGTTCAGA），80,000 pmole（干燥，脱盐）
3. 反向引物：SOD1HumanV2-104R（TTCACTGGTCCATTACTTTCCTTTAA），80,000 pmole（干燥，脱盐）
QIAamp 96 QIAcube HT套件（QIAGEN，产品目录号：51331）
PBS，磷酸盐缓冲盐水，10x溶液（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP3994）
酒精，试剂（变性酒精），70％（v / v）水溶液（Ricca Chemical Company，Fisher Scientific，目录号：25467032，室温易燃品柜）
Neosporin First Aid抗生素软膏（Hanna's Pharm Supply Co，目录号：302-571-8761）
棉花涂抹器（Fisher Scientific，Puritan，目录号：22-029-571）
50毫升试剂储存器（Corning，Costar，目录号：4870）
DL-二硫苏糖醇溶液BioUltra用于分子生物学，1 M在H 2 O（Millipore Sigma，Sigma-Aldrich，目录号：43816），4°C
乙醇，绝对（200 Proof），分子生物学级（Fisher Scientific，目录号：BP2818100），室温易燃品柜
无核酸酶水（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：AM9932）
TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fisher，Applied Biosystems，目录号：4371355），4°C
TaqMan Gapdh拷贝数测定（Thermo Fisher Assay ID Mm00186822cn），-20°C
样品制备溶液（参见食谱）
组织消化液（见食谱）
引物稀释溶液（见食谱）
SOD1 G93A 拷贝编号基因分型qPCR Master Mix（见食谱）
引物/探针解决方案（见食谱）

设备

用于组织收获乙醇洗涤的两个灭菌容器
用于收集耳组织的手术质量工具（镊子和剪刀，或耳塞）
振荡器能够在200转/分钟和56℃温育18小时（Eppendorf，New Brunswick，目录号：M1352-0010）（见注3）
Qiagen QIAcube HT（QIAGEN，目录号：9001793）（见注3）
SpectraMax M5多功能微孔板读板机（Molecular Devices，目录号：M5）（见注3）
NanoDrop TM 8000分光光度计（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号：ND-8000-GL）（见注3）
Allegra X-22R台式离心机（Beckman Coulter，目录号392188）（见注3）
QuantStudio TM 7 Flex实时PCR系统，384孔，桌面（Thermo Fisher，目录号：4485701）（见注3）

软件

Excel 2013（微软）
棱镜6（GraphPad， www.graphpad.com ）

程序

组织收集
注意：虽然该协议规定从耳朵样本中提取和分析基因组DNA，但也可以使用20 mg小鼠尾尖样本。
1. 制备
  1. 创建一个样板图，其中样本从上到下按列组织（即。，样本1在点A1中，样本2在点B1中，等。）。请记住，在每个实验中，需要为标准曲线保留8个样本点，因此可以在单个qPCR中分析的大多数小鼠是88（图4A）。
  2. 创建适当过量（至少10）的样品制备溶液（配方1）。＆nbsp;
  3. 使用Qiagen QIAcube Plasticware试剂盒中的S-Block，将160μl样品制备溶液加载到实验所需的每个色谱柱的每个孔中（图4B）。
    注意：QIAcube HT以列格式工作，并且需要填充所使用的列的每个井（无论它们是否包含样本），以使自动协议正常工作。
  4. 用粘性板密封件密封S型块的顶部。
    
    图4.样品采集板示例。 A.样品采集板图，用于88样品实验，标准曲线的占位符孔。 B. Qiagen S-Block。
2. 样品采集
  1. 用足够的70％试剂酒精填充两个干净的容器来清洗工具。
  2. 使用70％试剂酒精预清洁工具。
  3. 使用剪刀或耳孔从每只20毫克或更少的小鼠收集耳朵样品（图5）;使用镊子，根据平板图将样品放入适当的孔中。
  4. 使用带有棉签的涂抹器在小鼠耳朵上涂抹抗生素软膏。
    注意：抗生素拭子通常不需要在使用之间进行清洁，但如果鼠标出血，我们会更换脏污的拭子。
  5. 在第一次酒精洗涤时漱口镊子和剪刀，用酒精预备垫擦拭去除任何固体材料如毛发，然后在第二次酒精洗涤中漱口。将工具留在第二次洗涤中，直到准备再次使用;不要混淆洗涤，因为第一次洗涤应起到“脏洗”的作用，第二次洗涤应起到“清洗”的作用。
  6. 对剩余的老鼠重复，经常更换酒精预备垫和清洁手套。
  7. 完成后以及任何长时间休息时，用粘合剂覆盖S块。
    
    图5.耳组织样本约为20毫克
3. 样品消化
  1. 在试剂储库中，制备适当过量（至少10）的组织消化液（配方2），充分混合，无菌加载40μl到S-块的样品孔中;将配方加载到任何“空白”孔中（使用过的柱中没有样品的孔）。
  2. 确保每个样品都浸没在水中。
  3. 密封S型块，带有热稳定的粘性板盖;使用实验室胶带增加额外的安全性，以便在过夜消化过程中粘性覆盖物不会脱落（如果发生这种情况，样品会蒸发）。
  4. 固定在温度为56°C的热振荡器中;在200转/分钟下振荡过夜或最多18小时。
基因组DNA提取
1. QIAcube HT设置
  1. 隔夜样品消化后，打开QIAcube HT的QIAamp 96协议。
  2. 按照QIAamp 96 QIAcube HT协议中的设置向导输入样品编号并进行以下自定义。
    1. 使洗脱体积为150μl（图6A）。
      注意：在我们的手中，150μl洗脱产生的样品产量在10-50 ng /μl之间，我们发现这是样品稀释的最佳范围。您可能需要更改洗脱体积以优化产量范围。＆nbsp;
    2. 删除Top Elute（将音量更改为0）（图6B）。
      注意：通过实验，我们发现使用Top Elute是混乱的，不会提高样品产量或质量。
  3. 根据软件程序的规格设置卡座。
  4. 在运行协议之前，用电离枪或风扇将甲板去离子。
    
    图6. QIAcube设置。 A.将洗脱缓冲液设置为150μl。 B.将Top Elute体积设置为0μl。
2. 储存：协议完成后，用胶带和盖子盖住洗脱板，贴上标签，并在4°C下储存，直到准备使用。
  注意：该套件指示用户使用橡胶管帽，但我们发现这种情况很麻烦，并且液体进入另一口井的可能性增加。
基因组DNA稀释
1. 使用平板读数器或MultiDrop读取DNA的260 nm，280 nm和320 nm读数（如果使用平板读数器，在UV平板中将gDNA 1:10稀释在水中）。
2. 量化浓度和260/280比例;确保260/280值约为1.8。
  注意：另一个表示样品纯度的比率为260/230。理想的260/230值至少为1.0，但我们没有发现260/230值对qPCR结果有显着影响，因此在本协议中没有进一步解决。
3. 找到浓度最高的样本;为整个板选择一个稀释因子，确保最高浓度样品不超过1 ng /μl，最低浓度样品不低于0.02 ng /μl。
4. 用新板中的PCR-清洁水稀释所有样品并充分混合。
标准曲线设置
1. 将由几种不同SOD1 G93A 小鼠制成的几个样品的高质量基因组DNA组合并混合至总共约100μl的混合样品。
2. 找到浓度（理想情况下，使用NanoDrop获得最准确的结果）;做一些重复以确保绝对。
3. 用PCR-清水将样品稀释至80 ngl体积中的2 ng /μl;将剩余的混合gDNA原液保存在-20°C，以备将来的标准曲线使用。
4. 从70μl的2 ng /μlgDNA开始，在PCR板的一列中的PCR-清水中进行8次连续两倍稀释;这样就形成了一条标准曲线，其中最浓缩的样品为2 ng /μl，最小浓度为0.016 ng /μl（图7）。
  注意：如果您经常使用它们，您可以一次制作多条标准曲线，并将它们存储在4°C。
5. 用粘性板密封剂覆盖并在4°C下储存。每次使用标准曲线时都要使用无菌技术。
  
  图7. 96孔混合器板中的标准曲线设置
qPCR设置
1. 引物设置
  1. 根据“Primer Dilution solution”（配方3）稀释干燥的底漆;在板凳上离开10分钟，旋转，旋转下来。
  2. 将其等分成100μl等分试样，标记并在-20℃下储存。
  3. 将湿探针等分成20μl等分试样，标记并在-20°C下储存。
2. qPCR Master Mix
  1. 根据“SOD1 G93A 拷贝数基因分型qPCR主混合物溶液”（配方4），使用适当的过量进行混合（确保在样品数量计算中包括标准曲线，并为两个基因做足够的， SOD1和Gapdh）。
  2. 使用适当的过量，根据“Primer / Probe solution”（配方5）创建SOD1和Gapdh混合物。请记住，在计算过量时，您可以使用最多用于SOD1和Gapdh混合物的主混合物的过量样品数量的一半。轻轻混合;储存在4°C，用箔覆盖，直到准备使用（不超过1-2小时）。
  3. 分别标记2个96孔PCR板“SOD1”和“Gapdh”。
  4. 将4μl稀释的未知gDNA等分到每个平板中。
  5. 在Gapdh板上的最后一列样品后加入4μl标准曲线。
  6. 将20μlSOD1主混合物等分到SOD1板的每个样品孔中;移液器混合得很好，但不会引入气泡。用Gapdh板和主混合物重复。
  7. 旋转板在180 x g 下旋转3分钟。
  8. 从SOD1板开始，用38通孔qPCR板用8通道移液管移取9.8μl复制品，使样品占据A，C，E，G，等行。直接用Gapdh重复在SOD1行下，使Gapdh样本占据行B，D，F，H，等。;确保包括标准曲线（图8）。
    
    图8. 384孔板中qPCR板图的几个示例列。 Gapdh标准曲线样品将在添加所有样品后一式两份加入到最后两列中。
  9. 在400 x g 下旋转3分钟。
  10. 用光学平板密封剂密封平板并运行标准长度的TaqMan qPCR（图9）。
    
    图9. qPCR机器设置的标准长度基因分型qPCR循环条件

数据分析

组织数据
1. 将以下数据从qPCR机器导出到Microsoft Excel：Raw Ct，Sample Name，Target Name。
2. 找出每组重复的平均原始Ct。
使用标准曲线查找插值浓度的未知数
1. 在GraphPad Prism中打开XY电子表格;选择“输入X值”和“为每个点输入并绘制单个Y值”。
2. 标记X列“浓度，ng /μl”和第一个Y列“Gapdh Ct”。
3. 在“浓度”的前8行中，放置标准曲线的浓度值（2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125,0.015625）。
4. 在“Gapdh Ct”列的前8行中，粘贴Gapdh标准曲线的原始平均Ct值。
5. 单击“分析”并选择“非线性回归”（如果需要再次选择，请选择半对数线-X为对数，Y为线性“）。确保选中“从标准曲线插入未知数”。
6. 确保“结果表”选项卡中的R平方值至少为0.99。
7. 从第9行开始，在“Gapdh Ct”栏下粘贴原始平均Gapdh Cts;将出现一个名为“Interpolated X Values”的新结果选项卡。
使用插值浓度标准化SOD1 Cts
1. 使用以下标题在Excel中创建一个表：Sample，Target Ct，Gapdh Concentration，Normalization Value，Normalization Coefficient，Log，Normalized SOD1 Ct。
2. 使用图10A将适当的值放入每列中。
查找相对副本号
1. 在单独的工作表中，粘贴“样本”及其“标准化目标Ct”值。使用Sort函数将它们从最低到最高Ct排名，并从1开始为它们分配等级数。如果样本中有野生型（Cts接近40），请不要在此表中包含它们。＆nbsp;
2. 使用以下标题在单独的Excel文档中创建表：Rank，Sample，Ct，Median，Ct-Median，Fold Change，Relative Copies。
3. 使用图10B，使用新排名表将适当的值放入每列。
  
  图10.用于Ct标准化和相对拷贝数计算的Excel表格设置。 A.使用插值Gapdh浓度对SOD1 Cts进行标准化。 B.相对拷贝数计算。
进行基因型调用
1. 如背景部分所示，我们发现16“相对拷贝”及以上使小鼠具有正常寿命。我们对15个相对副本和更少的小鼠进行“低拷贝”调用。
  注意：虽然我们发现15个副本是一个安全的阈值，但您可以像您想要的那样费劲。对于更大和更高功效的研究，将阈值改为18或20可能是值得的，以确保没有较低的拷贝小鼠被纳入研究。
2. 如果您正在分析螺柱尾部，请更加保守，因为这会影响您的殖民地的未来。我们使用18作为螺柱尾部的截止。
3. 值得跟踪每个队列的男性角色;如果一个队列中有大量的低拷贝，它们可能都是一个低拷贝雄性的后代。
代表性数据
请参阅随附的Excel文档“代表性数据电子表格08152018 “代表一组有代表性的数据，包括Excel公式。

笔记

尽管本文未描述基因分型方案，但使用该SOD1 G93A 基因分型方案对小鼠进行基因分型。
有很多方法可以获得高质量的基因组DNA;这种方法是关于我们的具体方法编写的，该方法经过优化和定制，可最大限度地减少交叉污染，
这个协议是用这件设备编写的;但是，你可以使用功能相当的另一件设备。

食谱

样品制备解决方案
组织消化液
引物稀释溶液
SOD1 G93A 拷贝编号基因分型qPCR Master Mix
引物/探针解决方案

致谢

我们承认Matt Ferola和Carlos Maya的勤奋和经验丰富的鼠标饲养;我们感谢Shawn Sullivan对获取历史数据的贡献。我们感谢Augie's Quest对这些研究的慷慨支持。我们感谢与ALS一起生活的人们对这项研究的启发。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

所有实验均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用指南所述的方案进行，并由ALS TDI的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。 IACUC ID为2016-011，有效期为2016年12月至2019年12月。

参考

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Morrice，J.R.，Gregory-Evans，C.Y。和Shaw，C.A。（2018）。肌萎缩侧索硬化的动物模型：模型有效性的比较。 Neural Regen Res 13（12）：2050-2054。
Vieira，F.G.，Hatzipetros，T.，Thompson，K.，Moreno，A.J.，Kidd，J.D.，Tassinari，V.R.，Levine，B.，Perrin，S。和Gill，A。（2017）。 CuATSM疗效在ALS的SOD1小鼠模型中独立复制，而未经金属化的ATSM疗法未能显示益处。 IBRO Rep 2：47-53。
Zwiegers，P.，Lee，G。和Shaw，C.A。（2014）。 hSOD1拷贝数的减少显着影响G37R（第29行）小鼠的ALS表型呈现：对评估推定的治疗药物。 J Negat Results Biomed 13：14