材料和试剂

移液器吸头
专用封闭透明容器
剃刀刀片
封口膜
巴斯德吸管
15毫升/ 50毫升聚丙烯管
液氮容器
显微镜载玻片
盖玻片
大麦（ Hordeum vulgare ）cv.Golden Promise种子，大麦种子播种在John Innes 1堆肥中，混合蛭石（4：1）在12 x 12 cm盆中
液氮
醋酸纤维素
无水丙酮
MES水合物粉末
盐酸
WGA，Alexa Fluor 488缀合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：W11261）
注意：此染料显示Alexa Fluor ® 488染料的明亮绿色荧光（激发/发射最大值~495 / 519 nm）。
Cellulase Onozuka R-10（Duchefa Biochemie，目录号：C8001）
注意：来自绿色木霉的纤维素酶Onozuka R-10.1纤维素酶单位（U）将从羧甲基纤维素中释放1.0μmole葡萄糖。
氯化钠
氯化钾
Na 2 HPO 4
KH 2 PO 4
PBS缓冲液（见配方1）

设备

镊子
移液器
剪刀
镊子
70微米尼龙网筛
恒温箱
离心分离机
GFP过滤器
落射荧光显微镜
-80°C冰柜

程序

解剖受感染的大麦叶
1. 在20 oC的16小时光照/ 8小时黑暗周期中种植大麦（ Hordeum vulgare ）cv.Golden Promises种子。保持植物充分浇水至关重要，因为干旱胁迫可以防止有效解剖表皮。
2. 在活的大麦植株上保存白粉病真菌（ B. Graminis f。Sp。 hordei ），在一个专用的封闭透明容器中，保护气流免受可能取代分生孢子的气流的影响。通过在感染健康植物前一天摇动接种罐来分辨旧分生孢子。
3. 在这个阶段，初生叶完全伸展。接种 B. Graminis 是通过在未感染的大麦上摇动重感染的植物进行的。植物将准备解剖接种后七天。
  注意：强烈建议在执行此程序时使用紧身面罩，以防止分生孢子进入操作员的呼吸道。
4. 准备剪刀，镊子，剃刀刀片，Parafilm，巴斯德吸管，15毫升/ 50毫升聚丙烯管和液氮。将两个50毫升管放入液氮容器中，并加入液氮。
5. 将5克醋酸纤维素溶于100毫升无水丙酮中，倒入15毫升聚丙烯管中。
6. 用HCl调节pH至5.3。在室温下将20ml MES缓冲液倒入50ml管中，将0.2g MES水合物粉末溶于100ml H 2 O中，制成10mM MES缓冲液。
7. 小心取出叶子并在取出叶子后等待几秒钟，等待几秒钟后取出叶子并等待几秒钟。然后将叶子放在两个巴斯德吸管上。
8. 让丙酮从叶子表面蒸发5-8分钟。
  注意：此步骤至关重要：醋酸纤维素膜需要足够干燥才能去皮;但是，如果叶子太长而无法渲染，枯萎会导致表皮解剖不可能。
9. 现在，将从叶子的其余部分除去附生的含有菌丝体的醋酸纤维素层的膜的剥离。在水上保持5分钟以确保充分保湿。
10. 按照这个步骤，转动叶子，使正面朝上。在叶尖附近轻轻按下剃刀，小心地向前和向后摇动刀片。
  注意：这一步骤是破裂的，需要一些试验和错误才能获得足够的经验来实现正确的解剖。目的是切除上部，正面表皮和部分叶肉，同时保留下层
11. 在抓住叶片尖端（这形成一个可用于拉动表皮的“突片”）并将切口保持在切口下方时，将背轴向上拉回。背面表皮，含有真菌吸器。
  注意：如果需要，可以通过用镊子推开其他层来释放表皮层。
12. 一旦自由，小心地以连续平滑的方式剥离下表皮。
13. 完成后，切开表皮并用镊子将其取下，取下叶尖（“标签”）。
  注意：要从表皮中分离吸器，请跳至步骤B1。
14. 在液氮中的两个50ml聚丙烯管中分别将冻干的附生和硬膜外物质快速剥离以备将来使用。
15. 储存在-80°C直至需要。
Haustoria隔离
1. 将漂浮的表皮置于50ml管中的15ml 10mM MES水合物缓冲液（pH5.3）中。
2. 一旦收集到足够的表皮条（我们在视频1中使用一个盆），在新的50ml管中加入200mg纤维素酶R-10到10ml MES缓冲液中。充分混合，使纤维素酶的最终浓度为2％（ / v）。
3. 用镊子小心地将所有解剖的表皮转移到新的混合物中。
4. 将悬浮液在28℃下孵育2小时，同时轻轻摇动（例如，在旋转平台上80rpm）。在孵育期间，纤维素酶将裂解上皮细胞并将吸收剂释放到孵育缓冲液中。
5. 孵育后，将70微米尼龙网筛置于50毫升管上，缓慢地将缓冲液倒入过滤器中，同时使用镊子作为屏障，以保留较大块未消化的植物材料。
6. 收集所有缓冲液后，在3,270 x g 的摇摆转子中离心10分钟，在4°C。
7. 离心后，颗粒应含有吸器。
8. 倒出上清液并保留颗粒状的吸器。
  注意：在此步骤之后，吸收剂可以在-80°C下长期储存或立即染色以显示（继续使用程序C）。
WGA-Alexa Fluor 488染色（质量控制可选）
1. 轻轻地将吸尘沉淀重悬于300μlPBS缓冲液（pH 7.4）中（配方1）。
2. 将WGA-Alexa Fluor 488加入混合物中至终浓度为10μg/ ml。
3. 通过倒置管几次充分混合。
4. 将混合物装入显微镜载玻片上，小心地将盖玻片放在上面。
5. 使用落射荧光显微镜在GFP过滤器下观察。
  
  视频1.将协议可视化为程序的视频记录

数据分析

代表性成果：上述方案提供了一种有效的酶促方法，可从宿主植物，大麦中获得 B. graminis 吸收剂。使用该方案获得的所有物质，包括附生菌丝体 - 含有醋酸盐条纹，有吸引力的流行病学果皮和纯化的吸附剂，可以在-80°C下储存，长期储存，直至需要进一步分析。一罐感染严重的大麦（大约80片叶子） 0.3克表皮和3-4×10 5 吸附剂（获得的吸烟剂的实际数量将取决于（NB包括醋酸纤维素薄膜，其构成该部分的主要部分，按重量计）通过WGA-Alexa Fluor染色后的落射荧光显微镜可以观察到分离的吸器的质量.488。大多数分离的吸器是高度支化的和完整的。足够小的植物碎片也可以通过70-μm尼龙网筛，因此在植物衍生的额外膜试验膜中第一次有限量的杂质，如图1B（箭头）所示。复杂的，例如叶绿体（图2，箭头）。

图1.用WGA-Alexa Fluor 488染色后可见的分离的吸器。 A.通过落射荧光显微镜观察并通过“GFP”过滤器观察到染色的吸器（荧光绿）。多个完整和成熟的吸器。 Bar =40μm.B。这显示了多重的吸器和围绕吸器的外围膜（箭头）。比例尺=10μm。

图2.带有一些杂质的分离的吸器过滤和离心后形成的颗粒不仅包括吸器，还包括一些植物碎片，例如叶绿体（自发荧光红，箭头）。比例尺=10μm。
叶绿体和细胞壁碎片。
过夜孵育产生最大数量的吸附剂：约5×10 （这被认为是thes）＆nbsp;我们测试了纤维素酶总体消化时间的几种选择：1小时，2小时，3小时和过夜。孵化1小时后仅释放不到30％的过夜消化后获得的最大值。消化2小时和3次孵化最大量的吸附物我们可以实现），但也有更多的植物材料碎片降低了分离的吸器的纯度。赚取3-4 x 10 5 haustoria，占最大值的80％以上。

讨论：白粉病真菌具有挑战性，因为它们对宿主植物的生长和发育具有绝对的要求。尤其是对于宿主细胞内发育的饲养结构的吸收，尤其如此。（Catanzariti et al。，2006; Micali et al。，2011）。以前已经发表了几种粉状霉菌吸附剂的亲和分离方法，包括 B. Graminis （Mackie et al。，1991; Micali et al。，2008）。然而，该方法证明了 B. graminis ，结合梯度离心和多次过滤，产生含80％吸器的颗粒;其余报告为细胞壁碎片和叶绿体（Godfrey 等人，，2009）。在以前的研究中，来自不同植物的大多数是通过酶的组合实现的，包括纤维素（Sun et al。，2013; Wu et al。，2017）。从大麦白粉病中获取相对纯净和完整的吸收剂，我们开发了一种快速有效的方法，依靠从叶子的其余部分解剖受感染的表皮，然后降解细胞壁和裂解表皮细胞。＆nbsp;
Barley cv.Golden promise因其对白粉病的高度接受而被选中以保持财务状况。适当数量的种子是值得的在这项研究中，我们使用大约3克种子用于10厘米直径的盆。为了确保高感染率，在幼苗密度的同时使用的植物不会太高而不能干扰初级叶的饱和接种。以这种方式，我们确保仅使用新鲜的分生孢子（<1天龄），导致终止地质学的高百分比成功，需要从用作接种物来源的植物中除去超过一天的分生孢子。年轻的叶子更容易解剖：在行人形成解剖的更高级阶段之间进行权衡取消对于孤立的成功是至关重要的。在实践中，我们发现在接种后7天（dpi）使用植物作为理想的折衷方案。此外，初生叶背面的表皮是我们经常只解剖原始叶片的背面表皮。与正面表皮或其他叶片的表皮相比，最容易解剖。＆nbsp;
增加纤维素酶浓度（高于2.5％）和各种酶（纤维素酶和macerozymes）的组合作为一组条件。及时iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso按照惯例，我们使用2％的纤维素酶来分解细胞壁以释放吸器，然而，他们发现它们很容易导致分离结构的低生存力（Wu et al。，2017）。在比较不同的孵育时间后，我们在大多数情况下都有一个合适的折衷方案。临界培养的时间是从植物衍生结构中获得高分离的吸附和低污染。＆nbsp;
＆nbsp;该协议将WGA-AF 488用于不锈钢分离的吸器，而不是使用考马斯蓝的传统方法。凝集素部分与可见的荧光结构和荧光结构荧光结构可见的真菌结构结合如果需要，可以通过用Calcofluor White染色来观察污染的植物细胞壁。＆nbsp;
＆nbsp;我们认为该协议可适用于其他具有适当修改的白粉病。

食谱

1x PBS缓冲液
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24克KH 2 PO 4
溶于800毫升蒸馏水中用HCl调节pH值至7.4 加入蒸馏水至总体积1L

致谢

LLC由中国奖学金委员会（CSC）的学生资助，BC由格雷戈里信托（伦敦帝国理工学院）资助。

竞争利益

作者声明，这里描述的工作没有相互竞争的利益。

参考

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