材料和试剂

注意：有关试剂的完整列表，请参阅Guo et al。（2018）。

移液器吸头（MidSci，目录号：AVR96用于200μl吸头，AVR96-12用于1.2 ml吸头）
微孔带（3M，目录号：1530-0）
Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：06-666A）
塑料蓝杵（Fisher Scientific，目录号：12-141-368）
24孔培养板（Fisher Scientific，目录号：07-200-686）
硝酸纤维素膜（Bio-Rad，目录号：1620112）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C4859）
MG132（Sigma-Aldrich，目录号：M7449）
兔多克隆抗MYC2（Guo et al。，2018）
兔多克隆抗FLAG（Sigma-Aldrich，目录号：F7425; RRID：AB_439687）＆nbsp;
山羊抗兔IgG-HRP二抗（Thermo Fisher，目录号：31460）＆nbsp;
Ponceau S（Sigma-Aldrich，目录号：P7170-1L）
液氮（校园内的Chemstore）
DMSO（Fisher Scientific，目录号：D159-4）
Linsmaier和Skoog包（CaissonLabs，目录号：LSP03-1LT）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220-10）
Tris base（Fisher Scientific，目录号：BP152-10）
SDS（Fisher Scientific，目录号：BP166-5）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
Bromophenol blue（Fisher Scientific，目录号：BP115-25）
2-巯基乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP176-100）
½MS液体培养基（见食谱）
2x SDS样品缓冲液（参见食谱）

设备

灭菌钳
Sartorius Entris分析天平
P1000移液器
黑与...德克尔电钻
无菌文化罩
微量
Mini-Protein Tetra Cell（Bio-Rad，目录号：1658001EDU）
Trans-Blot Turbo系统（Bio-Rad，目录号：1704155）

软件

ImageJ（ https://imagej.net/Fiji ），网站上为新用户提供的友好教程

程序

对于WT和 fer 突变体中的MYC2半衰期测量
注意：步骤A1至A4在无菌培养罩中进行。
1. 在1/2 MS平板上灭菌和发芽种子7天，垂直恒定光照在100μmolm -2 s -1 ，22°C。
2. 向24孔板的每个孔中加入1ml液体½MS培养基，每种基因型有5个孔。
3. 用一对无菌镊子，轻轻地将50毫克的整个幼苗转移到孔中。
  注意：50毫克幼苗的数量可以通过称重幼苗来预先确定。
4. 每孔加入5μl10mMMG132。 MG132的最终浓度为50μM。
5. 用Micropore胶带密封平板并在室温下以40RPM轻轻摇动孵育16小时。
6. 用P1000移液器轻轻地从孔中取出液体，并用1ml新鲜的½MS液体培养基洗涤幼苗。重复该过程总共洗涤5次。
7. 轻轻地向每个孔中加入1ml新鲜的1 / 2MS液体培养基，向4个孔中加入环己酰亚胺，并将相同体积的100％DMSO加入到1孔中作为每种基因型的对照，环己酰亚胺的最终浓度为200μM。
8. 通过用一对镊子轻轻挑出幼苗，以30分钟的间隔收集幼苗。在Kimwipes上擦干。轻轻地将幼苗放入微管中并在液氮中冷冻。＆nbsp;
9. 对于估计MYC2蛋白量的Western印迹，将150μl2xSDS样品缓冲液加入50 mg冷冻幼苗中，每隔10 s短暂停止一次研磨组织约30 s，用电钻安装蓝杵机。
10. 涡旋并将研磨样品煮沸5分钟并在冰上冷却1分钟。
11. 在微量离心机中全速旋转冷却的样品5分钟，并加载20μl至SDS-PAGE凝胶。 Mini-Protein Tetra Cell和Trans-Blot Turbo系统用于蛋白质凝胶电泳和转移。
12. 用适当的一抗和二抗进行蛋白质印迹检测蛋白质水平。
对于转基因植物中的MYC2-FLAG和MYC2 A12 -FLAG半衰期
1. 在含有庆大霉素的平板（75μg/ ml）上灭菌和发芽种子7天。
2. 向24孔板的每个孔中加入1ml新鲜的1 / 2MS液体培养基，每个基因型5个孔。
3. 用一对镊子轻轻地将50毫克幼苗转移到孔中。将板放置2小时，以尽量减少机械触感的影响。＆nbsp;
4. 将含有400μM环己酰亚胺的1ml½液体加入4个孔中，并将含有相同体积DMSO的1ml½液体加入1孔中。轻轻摇动盘子几次混合。环己酰亚胺的最终浓度为200μM。
5. 然后按照上述步骤A8-A12进行操作。
有关Western印迹的全面阅读，请参阅制造商的说明（ https://www.bio上的公告＃2895） -rad.com ）。

数据分析

Western印迹后，使用平板扫描仪扫描胶片。使用Ponceau S对膜进行染色并扫描染色的膜（或者，可以在转移后立即进行该步骤。然后在印迹之前用蒸馏水洗涤膜）。使用ImageJ测量感兴趣的蛋白质条带的强度和来自染色的Rubisco的强度。计算目标蛋白质与相应Rubisco的比率。蛋白质半衰期是比率减半的时间。例如，参见Guo et al。（2018）中的图3C和3D。或者，可以通过蛋白质印迹监测由于环己酰亚胺处理而其水平没有显着变化的管家蛋白，并用作参考而不是Rubisco。

食谱

½MS液体培养基
在2L Millipore水中，溶解一个Linsmaier和Skoog小包，然后加入20g蔗糖直至其完全溶解;在121℃和15psi下高压釜15分钟。使用前冷却下来＆nbsp;
2x SDS样品缓冲液
制备50毫升2×SDS缓冲液，混合10毫升0.5毫升Tris pH 6.8,10毫升100％甘油，10毫升20％SDS，0.02％（w / v）溴酚蓝和700微升2-巯基乙醇，用水将体积增加到50毫升

致谢

作者感谢Trevor Nolan博士编辑手稿。该研究得到了爱荷华州立大学文理学院和植物科学学院签名研究计划的支持。

利益争夺

Hong Hong Guo和Yanhai Yin是题为“调节受体样激酶以促进植物生长”的专利的共同发明人，US9512440B2。

参考

Guo，H.，Nolan，T.M.，Song，G.，Liu，S.，Xie，Z.，Chen，J.，Schnable，P.S.，Walley，J.W。和Yin，Y。（2018）。 FERONIA受体激酶通过抑制拟南芥中的茉莉酸信号传导有助于植物免疫。 Curr Biol 28（20）：3316-3324。 E6。
Jeong，J。S.，Jung，C.，Seo，J。S.，Kim，J。K.和Chua，N.H。（2017）。去泛素化酶UBP12和UBP13在茉莉酸酯反应中正向调节MYC2水平。植物细胞 29（6）：1406-1424。
Jung，C.，Zhao，P.，Seo，J。S.，Mitsuda，N.，Deng，S。和Chua，N.H。（2015）。 PLANT U-BOX PROTEIN10调节拟南芥中MYC2的稳定性。植物细胞 27（7）：2016-2031。