材料和试剂

移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：4652080、4652050、4652020、4652010）
烧瓶（Borosil，目录号：4980009、4980012、4980016、4980021）
量筒（Borosil，目录号：3021029）
离心管（橡树岭，目录号：541040）
安全锁管2.0毫升（Eppendorf，目录号：0030120094）
一次性培养皿（Tarson，目录号：460090）
吸管头（Tarson，目录号：521000、521010、521020）
0.2μm注射器过滤器（微孔，目录号：SLGP033RS）
0.2 cm电穿孔反应杯（Biorad，目录号：1652086）
DBH9:d.hansenii菌株CBS767（MTCC 3461）。/dhhis4（原稿，Minhas等人，2009年）
质粒pdh4（克隆细节参见Minhas等人2009年的材料和方法部分）
磷酸钠，二元酸（默克，目录号：567550）
一元磷酸钠（默克，产品目录号：567549）
二硫苏糖醇（DL-DTT）（西格玛，目录号：43815）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）
蔗糖（Sigma，目录号：S8501）
葡萄糖（Himedia，目录号：MB037）
琼脂（Himedia，目录号GRM026）
YPD肉汤（bd difco，目录号：df0428-17-5）
酵母最小培养基-SD基（克隆泰克，目录号：630411）
无菌水（实验室纯系列模型-分析紫外线）
YPD肉汤培养基（见配方）
含0.3m蔗糖的最小SD琼脂培养基（见配方）
YPD琼脂培养基（见配方）
1 M磷酸钠缓冲液，pH值7.5（见配方）
1 m D L-DTT（见配方）
1米蔗糖（见配方）

团队

孵化器，新不伦瑞克TMInnova44（Eppendorf，型号：M1282-0002）
紫外可见分光光度计（岛津，型号：紫外1900）
微型离心机（Eppendorf，型号：5415R）
离心机（REMI，型号：CPR-24PLUS）
水浴（Julabo，型号：Pura 4）
基因脉冲发生器（Biorad，型号：Genepulserxcell）
涡流（DLAB，型号：MX-S）
层流（海洋生命科学公司，型号：OLSC 113-4）
L-吊具（Himedia，型号：PW1085）
高压灭菌器

软件

tblastn ncbi网站上的搜索工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？程序=tblastn&page_type=blastsearch&link_loc=blasthome）

程序

注意：

在层流的立体环境下进行微生物培养的所有步骤。
在所有步骤中使用高压水。

< BR>

在YPD琼脂平板上从冷冻甘油原料（-70°C）中提取DBH9菌株。
将划线板在25°C的培养箱中培养3-4天或直到出现菌落。< BR> 注意：始终从新的条纹培养基开始，以提高转化效率。
将培养皿中的一个DBH9菌落接种在10毫升YPD肉汤中，并在烧瓶中培养用于APPX。在25℃下以200转/分的速度生长24小时（饱和培养）。
用分光光度计在600 nm处检查培养物的吸光度（在水中稀释10倍后）。
将120微升以上生长的饱和培养物（如果培养物的外径为3.0）重新接种到30毫升YPD肉汤中（以便获得0.045的初始a600纳米）。
注：再接种量可能随培养物的外径而变化。
将重新接种的培养物在25°C下以200转/分的速度培养约16小时，直到A600nm达到2.6-2.8（约4.3 x 107细胞ml-1）。
用分光光度计确认吸光度。< BR> 注：当收获细胞的600纳米为2.8时，已观察到转化子的数量急剧减少。
在4500x g的离心机中，用离心管在室温（rt）下离心10分钟，从液体培养物中提取细胞。
丢弃直通管。
在6毫升50毫米磷酸钠缓冲液中重新悬浮细胞颗粒，pH值7.5（含25毫米二硫苏糖醇）。< BR> 注意：在低转速下使电池悬浮液涡流5-10秒，以便重新悬浮。
在30°C水浴（预热）中培养细胞悬浮液15分钟。
用离心管在室温下离心4500x g10分钟，再次从悬浮液中提取细胞。
丢弃流过的液体。
用15毫升无菌水重新悬浮细胞颗粒洗涤细胞，并在室温下4500x g离心10分钟以获得细胞颗粒。
丢弃流过的液体。
重复步骤14-15。
将细胞颗粒重新悬浮在1.0毫升冰冷1米蔗糖中，并将整个冷冻细胞悬浮液转移到预冷2.0毫升安全锁定管中。
在4500x g下，在4°C下，在微型离心机中离心10分钟，再次收获细胞颗粒。
丢弃流过的液体。
最后，向细胞颗粒中添加175微升冷1米蔗糖，使最终体积的冷冻细胞悬浮液在安全锁定管中达到200微升。
用移液管均匀地重新悬浮细胞。
将0.25-1.5微克DNA（PDH4质粒）加入到冷冻细胞悬液中，并将整个混合物转移到0.2厘米的电穿孔反应杯中。
在2.3kv、50mfd和100Ω的设置下，使用基因脉冲发生器对混合物进行电穿孔。< BR> 注意：严格在冰上执行步骤17-22。
立即向电穿孔反应杯中加入800微升1 M蔗糖溶液（室温下保存）。
将200微升用PDH4转化的细胞用L-Spreader涂在SD最小培养基（含0.3 M蔗糖）板上。
将这些培养板在25℃下培养3-4天，以观察组氨酸原生质体阳性转化子的出现（因为复制载体pdh4具有dhhis4基因作为选择标记）。< BR> 注意：我们没有在其他酵母系中使用dhhis4作为选择标记。
一个额外的样本总是被用作没有DNA被添加的对照。
用0.25μg pdh4质粒dna转化的平板上约有3500个菌落。没有dna的对照转化不会出现菌落。

数据分析

有关详细信息，请参阅Minhas等人（2009年）。

食谱

ypd琼脂培养基
1. 在250毫升烧瓶中加入5.0克YPD肉汤粉
2. 加入2.0g琼脂粉
3. 将培养基完全溶解在100毫升无菌水中，并在15磅压力（121°C）下高压灭菌15分钟；
ypd肉汤培养基
1. 将5.0 g YPD肉汤培养基悬浮在250 ml烧瓶中的100 ml蒸馏水中
2. 完全溶解介质，并在15磅压力（121°C）下高压灭菌15分钟
sd最小琼脂培养基，含0.3m蔗糖（100 ml）
1. 将0.67 g酵母最小培养基SD碱添加到250 ml烧瓶中的80 ml蒸馏水中
2. 加入2.0g葡萄糖、2.0g琼脂和1.02g蔗糖
3. 把溶液混合均匀
4. 用蒸馏水将最终体积补充到100毫升
1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.5
1. 将20.209 g磷酸二氢钠加入刻度量筒（1000 ml容量）中的800 ml蒸馏水中，制备0.0754 m磷酸二氢钠溶液
2. 向上述溶液中添加3.394g磷酸二氢钠（0.0246m）
3. 将溶液均匀混合，并使用HCl或NaOH（如需要）将最终pH值调整至7.5。
4. 用蒸馏水将最终体积补充到1L
1米DL-DTT
注意：务必使用新制备的DL-DTT溶液。
1. 将0.154g dl-dtt加入1.0ml无菌dh2o的安全锁定管中
2. 通过吸管完全溶解，并通过0.2μm注射器过滤器对原料进行消毒。
1.0米蔗糖
1. 将34.23 g蔗糖添加到250 ml烧瓶中的80 ml无菌dh2o中。完全溶解
2. 将最终体积补充至100毫升，并按照上述说明进行高压灭菌。

致谢

这项研究得到了印度新德里科学和工业研究理事会的支持。特别感谢阿洛克·蒙达尔博士指导原著并撰写已出版的手稿。
&nbsp；我们要感谢我们的原始出版物“Minhas，A.，Biswas，D.和Mondal，A.K.（2009）。汉森德巴酵母高效转化和基因断裂宿主及载体的构建。fems酵母res9（1）：95-102。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的兴趣。

工具书类

Minhas，A.，Biswas，D.和Mondal，A.K.（2009年）。在汉森德巴酵母fems酵母res9（1）：95-102中高效转化和基因破坏的宿主和载体的开发。
Ricourte，M.L.和Govind，N.S.（1999年）。质粒载体的构建和海洋酵母的转化hansenii德巴酵母mar biotechnol（ny）1（1）：15-19。

Voronovsky，A.A.，Abbas，C.A.，Fayura，L.R.，Kshanovska，B.V.，Dmytruk，K.V.，Sybirna，K.A.和Siberny，A.A.（2002）。黄原酵母famata转化系统的开发。fems酵母res2（3）：381-388。