材料和试剂

注射器过滤器（0.45μm，无菌，PTFE，VWR，德国，目录号：514-0073）
1.5毫升微管（GenoPlast，Poland，GP30623B / 80-1500）
250毫升Erlenmeyer玻璃烧瓶（Simax，德国）
50毫升FALCON型离心管（GenoPlast，Poland，GP440PSK）
培养皿（直径12厘米）
封口膜
C的细胞培养。 merolae ，10D（NIES-3377 Unialgal，Clonal和axenic或NIES-1332，Unialgal，Clonal和Non-axenic）菌株获自Microbial Culture Collection（mcc.nies.go.jp，Tsukuba，Japan）。并在整个研究中使用
注意：细胞在MA2液体培养基（Minoda等，2004）中在连续白光（50μmol光子m-2 s-1;用Quantitherm PAR / Temp Sensor测量）下在玻璃容器中生长42° C或培养皿中充满MA2培养基，加入1％（w / v）琼脂（Blirt，波兰）固化。
变形矢量
转化载体的构建完全取决于DNA整合的方法或预期实验的一般构建。例如，可以通过双同源重组敲除基因。为此目的，转化载体应该由目的基因序列的3'和5'末端的两个长度为500-1000bp的同源侧翼组成。两个侧翼应与组成型启动子下的一系列选择标记基因（cat-Chloramphenicol acetyltransferase）连接，例如，（P apc ）（Zienkiewicz et al 。，2018）。
琼脂（LE Standard Blirt，波兰，产品目录号：AG41）
PEG（Polyethylene glycol，Fluka，Germany，目录号：BCBC0873）
（NH 4 ） 2 SO 4 （Chempur，Poland，CAS：7783-20-2 WE：231-984-1）
MgSO 4 ·7H 2 O（波兰Chempur）
KH 2 PO 4 （Chempur，Poland，CAS：7778-77-0 WE：231-913-4）
CaCl 2 ·2H 2 O（波兰Chempur，CAS：10035-04-8 WE：233-140-8）
EDTA·2Na（Carl Roth，德国，CAS：6381-92-6 EG-Nr.205-358-3）
FeCl 3 ·6H 2 O（Chempur，Poland，CAS：10025-77-1 WE：231-729-4）
H 3 BO 3 （Chempur，Poland，CAS：10043-35-3 WE：233-139-2）
MnCl 2 ·4H 2 O（Chempur，Poland，CAS：13446-34-9 WE：231-869-6）
ZnCl 2 Chempur（波兰，CAS：7646-85-7 WE：231-592-0）
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O（Chempur，Poland，CAS：10102-40-6 WE：231-551-7）
CoCl 2 ·6H 2 O（波兰Chempur，CAS：7791-13-1 WE：231-589-4）
CuCl 2 ·2H 2 O（波兰Chempur，CAS：10125-13-0 WE：231-210-2）
PEG 4000（德国弗鲁卡，化学文摘社：25322-68-3）
氯霉素（加拿大bioshop，cas:56-75-7，批号：8e55095）
氯霉素（见配方）
MA-1（见配方）
MA2（艾伦培养基）和10x MA2（minoda等，2004，见配方）
琼脂-固化板（见配方）
A2 Fe-EDTA溶液（见配方）
A2微量元素储备溶液（见配方）
PEG 60%（见配方）

设备

温度调节离心机（德国Eppendorf离心机，型号：5810R和5415R）
分光光度计（日本岛津，型号：UV-1800）
NanoDrop（例如，>，NanoDrop Lite，Thermo，美国）
Quantitherm PAR/Temp传感器（英国汉扎特）
生长室/孵化器（42（c）和50软m-2 s-1光的可持续条件）
轨道振动筛

程序

c.merolae>标准生长条件
1. 标准生长培养基为MA2艾伦培养基（配方2）。我们建议制备含有A2微量元素、不含A2-Fe-EDTA的10倍浓MA2储备液，并对其进行高压灭菌。每制备一种新的培养基，稀释适当的体积。高压灭菌后添加A2 Fe-EDTA（配方4）。
2. 培养物应生长在透明的无菌容器中，其体积至少是细胞培养物的5倍（例如，50ml培养物放在250ml烧瓶中）。
3. 培养物必须轻轻搅动（30-50转/分在眼眶振动筛上）。
4. 培养物必须无菌，因此任何培养容器必须关闭，但必须允许气体交换。大气中的co2足以生长，但空气中的co2可高达5%。
5. 光强度应在连续照明的50-100 photo-2 s-1之间。
6. 在37-42的温度范围内，生长速率相似。
7. merolaec.merolae的od应控制在0.01～1之间。我们建议每周一次或每两周更新一次，从旧培养物体积的1/100中接种新鲜培养物。
merolae细胞的peg转化
1. 在转化前一周至少建立（重复工作）2x50ml的od7500.1的培养基，并使其在标准条件下生长至od7500.4。
2. 在转化前两天，引入8/16ho光/暗的光周期。
3. 转换前一小时暴露在标准光照条件下（如果黑暗期未完成）。
4. 在40°C和2000x g下旋转100毫升培养液5分钟。
5. 在40°C下，将颗粒重新放入50毫升MA-1溶液中，并在40°C和2000x g>下再次旋转5分钟。
6. 在40°C下，将小球重新放入0.5毫升MA-1溶液中（现在准备好进行转化）。
7. 产生大量（50μg以上）高浓度（200 ng/μl以上，在纳米滴上精确测量）的转化载体。
8. 在总共400μl MA-1缓冲液中将转化载体稀释至20μg。
9. 将100μl细胞悬液加入400μl DNA中，通过上下移液2-3次轻轻混合。
10. 加入500μL 60%无菌PEG，轻轻与针尖混合（PEG的最终浓度应为30%）。
11. 室温下孵育5分钟。
12. 将细胞悬液转移至50 ml MA2，在40°C和2000x g>下旋转5分钟，再重复一次。
13. 在50毫升MA2培养基中重新培养，并应用标准生长条件。
14. 允许在连续光照下生长3天，然后引入可选条件-150μg/ml的氯霉素形成100 mg/ml的新制备储备溶液。
15. 培养物应褪色（慢慢变成黄色/白色），然后恢复生长（通过呈现绿色）。
16. 2-3周后，将500μl培养液移入250 ml烧瓶中的50 ml MA2培养基中。
17. 在1%（w/v）琼脂固化的ma2培养皿上培养50μl，用副膜密封3次，以避免过度蒸发和干燥培养基基质。
18. 允许在标准条件下生长，直到出现菌落。
19. 挑取20-50个菌落，转移到250毫升的烧瓶中，其中50毫升的MA2含有100μg/ml氯霉素。
20. 生长到od750=0.4后，分别用150、200和250μg/ml氯霉素接种到ma2培养基中。
21. 使其生长约2周，达到OD750~0.5。
22. 从成功的、最高浓度的氯霉素培养的存活培养物中接种新培养物。
23. 只要有必要，通过适当的遗传方法（例如，>，通过wt和改良基因组特异性qpcr，southern blott）重复上述步骤，整个过程所需的时间可能会有所不同，通常需要6个月左右。

数据分析

由于2-3周的可选择生长期，随后在固体培养基上电镀细胞，因此不可能接近转化效率。然而，在我们先前的尝试中（zienkiewicz等，2017a），我们在11次尝试中有10次获得了可行的菌落。引入的突变为细胞提供了抗性基因，而没有破坏任何原生基因。当引入功能基因的任何突变时，根据感兴趣的基因，应该期望更低的效率。可通过逐步增加培养物的多次传代（通常，每一次传代将氯霉素浓度增加50微克/毫升）选择标记物的浓度来实现均一性。由于叶绿体基因组存在多个拷贝，因此很难产生同源的叶绿体突变体。根据我们的经验，这需要3到6个月的时间，而且需要更高浓度的氯霉素。此外，存在wt和修改的叶绿体基因组的多个拷贝可能导致最佳的异质性，其中一个细胞必须保持两个版本，以承受特定的最大浓度的氯霉素。感兴趣的基因越重要，发生的可能性就越大。

食谱

MA-1（100毫升）（表1）

表1。MA-1缓冲组件
注意：在转化预热至40°C之前，不要调节高压灭菌器的pH值，并在室温下保存无菌。
MA2（艾伦介质）（表2）

表2。MA-2缓冲组件
注：将pH值设置为2.5，高压灭菌，并在室温下保存无菌
琼脂固化板（表3）

表3。琼脂固化板组件
注：将琼脂分别在水中高压灭菌，当两种溶液冷却至约60°C时，在无菌条件下与MA2溶液混合。
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a2-fe-edta溶液（表4）

表4。a2-fe-edta溶液组分

注意：首先溶解EDTA并将pH值设置为7，然后添加FeCl3，过滤消毒，保存在4°C下。>
A2微量元素储备溶液（表5）

表5。A2微量元素原液成分
注：高压灭菌器，储存在4°C下。>
PEG 60%（w/v）（表6）

表6。PEG 60%组分
注：至少提前一天制备PEG并使其溶解过夜，用注射器过滤器（0.2μm）过滤溶液。储存在室温下
氯霉素（100 mg/ml）储备溶液（表7）

表7。氯霉素（100 mg/ml）储备溶液成分
注意：每次都要准备新鲜的，不要储存。>