材料和试剂

多步骤使用的材料和试剂
1. 手套
2. 无核糖核酸酶试管（例如>，1.5毫升Eppendorf试管，或等效物）
3. 原位篮（样品容器，如图1a所示）
  它们可以是netwell篮（康宁），也可以是由尼龙网和微型离心管构成的自制篮，如sive等人所述。（2007年）。篮的大小取决于样品的类型；它们通常适合6、12或24孔板的井内。建议在篮（而不是试管）中进行原位杂交：
  1. 减少因移液管而造成的样品损失和损坏。
  2. 为了加速溶液的交换（篮子可以在镊子的帮助下简单地转移到带有新溶液的多孔板上（图1b）–在这种情况下，轻轻敲击篮子，使其紧靠井壁，以确保清除旧溶液，然后轻轻地将其浸入新井中）。
  3. 篮子可以循环多次，在彻底清洗后（e.g.>，用milliq h2o冲洗，然后浸入1 M NaOH溶液中和RNase，并用无RNase的milliq h2o冲洗几次-只需将它们放在烧杯中的摇床上即可确保水平旋转）。
    
    图1。样品载体。a.三个网底篮子的示例。b.24孔板，用于原位杂交。c.相同的板，封闭并用塑料薄膜包裹，以避免杂交步骤中的蒸发。
4. 多孔板（用于安装原位篮，如图1b所示）；（例如，24孔细胞培养板，无菌，带盖，来自Cellstar（格雷纳生物一号，目录号：662-160）
5. 冰和冰容器
6. 毫希2o（储存：室温）
7. 吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379），储存：RT（温和洗涤剂）。鉴于其高粘度，建议制备10%的工作溶液）
8. Na2HPO4·7h2O（Sigma Aldrich，目录号：431478），储存：RT（用于制备10x PBS溶液）
9. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888），储存：RT（用于制备10X PBS溶液）
10. KCL（Sigma-Aldrich，目录号：P9333），储存：RT（用于制备10倍PBS溶液）
11. kh2po4（sigma-aldrich，目录号：p9791），存储：rt（用于制备10x pbs溶液）
12. 10x PBS（磷酸盐缓冲盐水）pH值7.4（见配方，或Calbiochem药片，目录号：524650），存储：RT（有助于保持恒定pH值）
固定
1. 37%甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：252549），储存：RT（交联）
2. 8%戊二醛（电子显微镜科学，目录号：16020），储存温度：4℃（交联）
3. egta（乙二醇双（2-氨基乙醚）-n，n，n'，n'-四乙酸）（sigma-aldrich，目录号：e3889），储存：rt[钙/镁] 螯合剂，可降低酶活性（如rnase）；hem缓冲液试剂]
4. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034），贮存：RT（HEM缓冲液试剂）
5. mgso4（sigma-aldrich，目录号：m7506），存储：rt（hem缓冲液试剂）
6. 吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379），存储：RT
7. 甲醇（例如>，Sigma-Aldrich，目录号：322415），储存：RT
8. 1x PBS（见配方）
9. 1x PBST（见配方）
10. CISH固定缓冲液（见配方）
11. 鱼固定缓冲液（见配方）
12. 脱水缓冲液（见配方）
13. 补液缓冲液（见配方）
14. 再固定缓冲液（见配方）
乙酰化
1. tea（三乙胺）（sigma-aldrich，目录号：t0886），存储：rt（用于减少带负电探针与组织的非特异性结合）
2. 醋酸酐（Sigma-Aldrich，目录号：A6404），储存温度：4℃（用于减少带负电探针与组织的非特异性结合）
3. 1x PBST（见配方）
4. 10倍茶原液（见配方）
5. 0.1米茶（见食谱）
6. 0.1米茶叶中0.25%醋酸酐（见配方）
渗透性
1. 蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P4850），储存温度：4°C或-20°C（消化蛋白质，包括核酸酶）。最适ph值为7.5-9.0）
2. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898），储存：RT（用于中和蛋白酶K）
3. 1x PBST（见配方）
杂交
1. 塑料薄膜（用于杂交步骤中包装样品容器）
2. 尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U5378），储存：RT（变性剂）
3. 右旋糖酐硫酸钠，mr~200'-00（sigma-aldrich，目录号：67578-25g），存储：rt[增加分子拥挤，因此可以加速杂交动力学（局部增加探针浓度）]
4. trna，来自面包酵母（sigma-aldrich，目录号：10109509001），储存温度：-20°C（阻止非特定探针结合）
5. 鲑鱼精子（Thermo Fisher，目录号：156312011），储存温度：-20℃（阻止非特异性探针结合）
6. 肝素钠（Thermo Fisher，目录号：10239840），储存温度：-20°C（通过与与DNA结合的蛋白质结合，有助于降低背景温度）
7. 20%十二烷基硫酸钠（Fisher，目录号：BP131），储存：RT（洗涤剂）。渗透膜，促进探针分布）
8. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888），储存：RT（盐。准备20X SSC储备缓冲液，见配方）
9. 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）（制备20X SSC储备缓冲液，见配方）
10. 吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379），存储：RT
11. 10x dig标记混合rna（罗氏，目录号：11277073910），储存温度：-20℃（用于探针合成）
12. rnasin核糖核酸酶抑制剂（promega，目录号：n2111或n2511），储存温度：-20°C（用于探针合成）
13. DTT（Promega，目录号：p1171），存储温度：-20°C（用于探针合成）
14. 转录优化5x缓冲液（Promega，目录号：p1181），存储温度：-20℃（用于探针合成）
15. T7/SP6/T3 RNA聚合酶（Promega，目录号分别为：p2075/p1085/p2083），储存温度：-20℃（用于探针合成）
16. RQ1无核糖核酸酶DNA酶（Promega，目录号：M6101），储存温度：-20°C（用于探针合成）
17. Illustra Probequant G-50微柱（GE Healthcare，目录号：28-9034-08）（用于探针合成）
18. 1x PBST（见配方）
19. 8 m尿素储备溶液（见配方）
20. 20X SSC（枸橼酸钠或标准枸橼酸盐）（见配方，或来自Sigma-Aldrich，目录号：S6639），存储：RT[控制严格性（探头到目标的退火）]
21. 洗一次（见食谱）
22. 洗二（见食谱）
23. 洗三（见食谱）
24. 尿素基100%杂交缓冲液（见配方）
25. 尿素基50%杂交缓冲液（见配方）
抗体孵育
1. 抗地高辛AP，Fab片段（Roche应用科学，Sigma-Aldrich，目录号：11093274910），储存温度：-20℃[识别地高辛半抗原，与碱性磷酸酶（AP）结合]
2. 抗地高辛吊舱，Fab片段（罗氏应用科学公司，Sigma-Aldrich，目录号：11207733910），储存温度：-20℃[识别地高辛半抗原，结合辣根过氧化物酶（POD）]
3. 阻断剂（Sigma-Aldrich，目录号：11096176001），储存温度：20-25°C（减少抗体的非特异性结合）
4. 马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375），储存：RT（用于制备单克隆抗体）
5. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888），储存：RT（盐。用于制备单克隆抗体）
6. NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：221465），贮存：RT（用于制备单克隆抗体）
7. 10x封闭试剂储备溶液（见配方），储存温度：-20°C
8. 10x MAB（马来酸缓冲液）储备溶液（见配方）（用于稀释封闭缓冲液，在SSC清洗后使用）
9. 1x mAbt缓冲区（见配方）
10. 10x封闭试剂储备溶液（见配方），储存温度：-20°C
11. 1x块缓冲区（见配方）
检测
1. 铝箔（用于染色步骤中保护样品）
2. BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯）/NBT（硝基蓝四氮唑）显色底物（Promega，目录号：S3771），储存温度：4°C或-20°C[产生暗（蓝/紫）沉淀的碱性磷酸酶底物]
3. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888），储存：RT（盐。ntmt缓冲组件）
4. mgcl2（sigma-aldrich，目录号：m8266），存储：rt（ntmt缓冲液成分，mgcl2是碱性磷酸酶的必要辅因子）
5. tris hcl（tris盐酸盐）（sigma，目录号：t3253），储存：rt（ntmt的ph缓冲成分）
6. 吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379），存储：RT
7. 左旋咪唑（安捷伦达科，目录号：x302130-2），储存温度：2-8℃（碱性磷酸酶抑制剂）
8. TSA PLUS荧光放大试剂盒，菁3/5（Perkin Elmer，Waltham，MA；目录号：NEL752001KT），储存温度：4℃【酪酰胺信号放大（TSA）试剂盒使用辣根过氧化物酶（HRP或辣根过氧化物酶）催化荧光标记自由基的沉积】
9. H2O2（Sigma-Aldrich，目录号：516813），储存温度：4℃（辣根过氧化物酶底物）
10. 注射器过滤器（Millex GS，目录号：SLGS033SS）（用于过滤NTMT缓冲液，以避免沉淀）
11. 一次性注射器（例如，>，50毫升，来自Thermo Scientific，目录号：S7510-50）（用于过滤NTMT缓冲液，以避免沉淀）
12. 5 M NaCl储备溶液（用于制备NTMT缓冲液，见配方），储存：RT
13. 1 M Tris HCl，pH 9.5储备溶液（用于制备NTMT缓冲液，见配方），储存：RT
14. 1 m mgcl2储备溶液（用于制备ntmt缓冲液，见配方），储存：rt
15. ntmt缓冲区（见配方）
16. ntmt减去缓冲区（见配方）
17. ntmt缓冲区中的nbt/bcip（见配方）
存储和安装
1. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516），储存：RT（安装介质）
2. citifluor-af1（citifluor，目录号：af1-100），存储：rt[荧光样品的安装介质（硬化、抗老化/抗漂白）]
3. 从针状玻璃（安装）上滑动（例如，76 x 26 mm，带磨砂端（标签实用）
4. 盖玻片（例如，>，20 x 20 mm，厚度1，来自针织玻璃）（安装）
5. Nailpolish（用于密封安装的标本；任何商业指甲油都可以使用，但是更喜欢透明的，并在较小的重要的测试。样品，以防含有过多的溶剂——这可能会损坏样品）

设备

注：不提供特定品牌/型号；实验室通常提供此设备。>

移液管
加热块（用于探头变性，例如>，温度范围为10-100°C）
金属镊子（用于转移篮子，例如>，来自精细科学工具）
水浴/杂交炉（杂交和严格洗涤）
带耐高温螺旋盖的玻璃瓶（例如，>，Fisherbrand 250 ml瓶（目录号：FB-800-250）；VWR 500 ml瓶[硼硅酸盐3.3；目录号：215-1594）；Scott Duran 1000 ml瓶（原GL 45系列）]
pH计（用于调节溶液的pH值）

程序

样品处理的一般注意事项：>

样品固定最好在密封的无核糖核酸酶容器中进行，如Eppendorf或Falcon管。
一旦样品再水合，它们就可以转移到无rnase的原位杂交篮中（如图1a所示）。
样品的密度可能会影响原位杂交结果：过多的小瓶/篮通常会产生染色不良/损坏的样品，过少的样品（例如，一个胚胎）可能会过度染色（可能是由于探针/靶点比例不平衡造成的）。

样品固定/脱水（表1）
注：
1. 应根据实验室安全指南处理和处置固定剂。
2. 固定（固定剂的选择、固定时间）必须适应样本类型。
3. 提供了两种可供选择的固定方式，用于比色原位杂交（CISH）和荧光原位杂交（FISH）。>
  
  表1。固定a
再水化（表2）

表2。再水化
（可选）>渗透性；蛋白酶k处理渗透性组织（表3）
注：
1. 每批新酶的处理时间应滴定，因为强度可能不同。一个有用的经验法则是对测试样本进行处理，直到出现组织损伤，并将结果时间减半（有关更多详细信息，请参见注释部分的图3）。
2. 这一步骤对于非常脆弱的组织来说可能是不必要的。
>表3。渗透性
（可选）乙酰化（表4）
注意：由于探头与带正电表面结合，此步骤可能有助于减少非特定信号。>

表4。乙酰化
（可选）重新固定（表5）
注：
1. 根据样本类型（例如脆弱的无脊椎动物胚胎），可能需要在杂交之前进行额外的再固定步骤。
2. 一般来说，蛋白酶K处理后最好重新固定。
3. 戊二醛可以省略：建议在第一次设置方案时测试几个选项。戊二醛渗透组织的速度较慢，对于厚度小于1 mm的样品，戊二醛的使用更为可取（Eltoum等人，2001年）。
表5。重新固定
杂交（表6）
注：
1. 在杂交前/杂交阶段不要让温度下降。转移吊篮或增加探头可能需要很长时间时间。处理多个样本时，请设置可管理的批处理。
2. 尿素基杂交缓冲液往往是粘性的，蒸发可能是一个重要问题，导致晶体的形成，将损害样品。小心密封小瓶/多孔板（图1c）。
3. 注意，在加热的杂交缓冲液中，一些样品类型可能会变得暂时透明。在这个阶段，它们也会更脆弱。>
表6。杂交

表6。继续
阻塞（表7）

表7。阻塞
信号检测
AP抗体，比色反应
表8。比色信号检测

表8。继续

荧光检测（pod抗体，信号放大）>（表9）

表9。荧光信号检测
CISH安装（表10）

表10。比色样品-安装
鱼架（表11）

表11。荧光样品-安装

数据分析

尿素变异体原位杂交方案产生了可靠的结果。样本形态保存良好，良好的信号背景比允许细胞分辨率检测基因表达。图2描述了在aclytiamedusa上执行的比色（cish）和荧光（fish）方案的结果。
关于甲酰胺和尿素方案的进一步比较，请参考原始论文（Sinigalia等人，2018年），例如来自不同物种的样本，以及结果的更详细分析。

图2。水母中基因表达的检测。rfamide>（clytia>基因的登录号：kx496951）在神经系统细胞中表达。尿素原位杂交法检测散布在水母体内的细胞，包括（从左到右）：触手、触角球茎、伞周的圆形管和伞。组织保存完好，特别是脆弱的伞。CISH的结果是，焦点集中在触手和圆管中的散在细胞上。用蔡司Axio成像仪A2拍摄的图像。b.FISH结果，用徕卡SP8共焦显微镜拍摄的Z叠加图像的最大投影（用斐济完成）。两幅图像均被裁剪；比例尺=50μm。

笔记

控制
1. 强烈建议同时进行阴性对照（例如，>，使用感测探针，或对未在所研究样本中表达的基因使用长度相似的探针）和阳性对照（使用可靠的已知反义探针），特别是在测试任何新探针或可选探针时步骤。
2. 当首次测试这种基于尿素的方案时，建议与最终以前的基于甲酰胺的方案（如果已经在实验室中使用）进行平行的原位杂交。
mrna探针
1. 核糖探针（mrna探针）可以由线性化的模板质粒或pcr产物合成。原始研究论文（Sinigalia等人，2018年）中所示的DIG标记的RNA探针，包括本方案中使用的rfamide>探针，是使用Promega的其中一个RNA聚合酶试剂盒（T7、SP6或T3多聚酶）合成的。插入）。对于探针合成，按顺序添加：2μl 10x dig标记混合rna（roche）；0.5μl rnasin核糖核酸酶抑制剂（promega）；2μl 100 mm dtt（promega）；4μl转录优化5x缓冲液（promega）；1-2μg dna模板（计算适当体积）；无rnase h2o至20μl总体积；0.5μl t7/sp6/t3 rna聚合酶（promega）。在37°C下反应2-5小时，然后用1.5μL RQ1无核糖核酸酶DNA酶（Promega）在37°C下消化DNA模板30分钟，然后加入30μL无核糖核酸酶H2O洗脱，用Illustra Probequant G-50微柱纯化（GE Healthcare）。通过在1%琼脂糖凝胶上运行1μL纯化探针，用纳米滴法定量检测探针完整性。探针可以储存在-20°C或-80°C，添加50%（v/v）无核糖核酸酶的甲酰胺有助于保持核糖核酸的完整性。
2. 建议始终合成反义（与mrna互补）探针和感测探针，作为结合特异性的对照。
3. 探针通常是根据基因的编码序列设计的，但它们也可以针对3’utr区域（这可能有助于区分高度相似的基因）。从cdna中克隆所需区域，可能来源于从感兴趣的阶段/身体区域提取的mrna（不同阶段/组织可能表达同一基因的不同剪接形式）。
4. 建议探头长度在500到800之间，最大为1500 bp。长探针可以通过碱性水解而破碎，例如>。
  碱性水解（Cox等，1984）：通过添加1:1体积的水解缓冲液（40 mm NaHCO3/60 mm Na2Co3，pH 10.2）新鲜水解探针在无核糖核酸酶的水中制备。在60℃下孵育一段时间（以分钟表示），计算如下：
  
  其中，l0是原始转录长度（以kb表示），lf是所需片段长度（以kb表示）。
  加入醋酸钠（0.1 m终产物，pH6.0）和冰醋酸（0.5%，v/v）中和，用乙醇沉淀。
调整协议/变体
1. 该方案基于原位杂交（sinigagliaet al>，2018年），但其目的是代表一般准则。当它适应新的研究有机体/组织/细胞时，建议首先用尿素溶液取代原始杂交缓冲液中的甲酰胺，最终浓度为4 M。
2. 方案的变体是可能的，特别是荧光原位杂交已经成功地与免疫染色或edu反应耦合（数据未显示）。
3. 该方案也可用于组织切片（冷冻或石蜡包埋），在这种情况下，可能需要进一步调整（例如>，降低洗涤剂或杂交缓冲液中的尿素浓度）。
4. 尿素基杂交缓冲液也可以用SMFISH进行检测。
5. 蛋白酶k治疗是可选的。蛋白酶K能消化蛋白质，从而使组织渗透，并有助于探针和试剂的渗透。治疗过强可能损害组织形态，而消化不足可能导致信号检测不良。每批新酶的培养时间和酶浓度都应进行评估。
  
  图3。蛋白酶k处理的滴定法。图像显示10μg/ml蛋白酶k在1x pbst中对固定的水母进行消化。治疗30分钟后开始出现可见损伤（黄色星号），40分钟后水母严重受损（注意绒毛和性腺分离）。根据指导方针根据主要方案（见表3），蛋白酶K处理应在原位杂交期间持续15-20分钟。
故障排除
1. 损坏样品
  1. 确保样品始终被溶液覆盖，不要让它们干燥。
  2. 确认杂交缓冲液没有蒸发。
  3. 再水化后，在杂交前加入第二个固定步骤。
  4. 去除渗透步骤，或最终缩短治疗时间。
  5. 小心处理样品和篮子。样品在甲醇和杂交溶液中可能更易碎。
  6. 如果损坏是由于在样品上形成晶体造成的，则尝试使用milliq h2o快速清洗样品。
2. 无信号/信号差
  1. 验证探针质量（检查降解情况）并使用正确的反义探针。长探针通常表现较差，但最佳长度是物种和基因特异性（目标是500-800 bp）。探针可以通过碱性水解而破碎（例如>，见注释部分的B4点）；这将提高对目标的穿透力和识别能力。
  2. 添加渗透性步骤/重新测试/更新蛋白酶K批次。
  3. 增加/减少杂交混合物中的探针浓度。
  4. 在CISH的情况下：延长信号检测步骤（经常更新NBT/BCIP混合，同时将样品保持在4°C）。如果是鱼：延长信号检测反应，或重复。
  5. 对于CISH：使用新制备的染色液。新制备的NTMT（如果超过一天请勿使用，在不使用时保持在4°C）。
  6. 如果是鱼：在使用前准备好缓冲液。
  7. 增加/减少杂交混合物中的尿素浓度（8 m至2 m）：一般来说，较高浓度将具有更强的渗透效果，建议用于难处理/硬组织。
  8. 验证溶液的pH值，特别是茶和SSC储备溶液的pH值。
  9. 样本可能是固定的，核实一下。最好去除戊二醛，以防将其添加到固定液中。
3. 非特定信号
  1. 对于CISH：将左旋咪唑添加到NTMT和染色混合物中。
  2. 对于CISH：在NBT/BCIP显色反应之前，延长与NTMT的孵育时间。
  3. 对于CISH：保护NBT/BCIP混合物不受光照。验证储备溶液没有变紫或变黑，并且看起来是均匀的。
  4. 在CISH的情况下：试着进行鱼类替代（允许更精确的观察，避免非特定沉淀物沉积的最终问题）。
  5. 通宵预杂交。
  6. 加入乙酰化步骤。
  7. 确保醋酸酐溶液（步骤d中的步骤1和2）得到有效混合，并且样品与之接触良好。
  8. 提高杂交温度。
  9. 降低探针浓度。循环探针（将杂交混合物储存在-20°C下）。
  10. 增加杂交后洗涤的持续时间/强度。通过改变ssc缓冲液的浓度来调节严格性（低严格性为5-6x，高严格性为2-0.1x）。
  11. 在开始显色反应之前，确保样品上没有灰尘/污垢：颗粒可能来自回收篮的洗涤不足、溶液（过滤它们，特别是NTMT溶液）、衣服。如果存在，请手动移除它们。
    一般来说，附着在样品上的微粒通常来自于旧溶液：更新它们，特别是染色剂，并精确地调节pH值。在染色前加入ntmt减去缓冲液（过滤）也可能有帮助。
  12. 对于CISH：扩展程序H（比色检测）和程序I中的步骤9（CISH安装），将样品保持在4°C。
  13. 验证溶液的pH值，特别是茶和SSC储备溶液的pH值。
4. 信号太强/太快
  1. 降低探针浓度。
  2. 对于CISH：稀释染色液。减少染色时间。在染色液中加入左旋咪唑和/或在4℃下进行染色反应，以减缓AP反应。
  3. 在CISH的情况下：试着进行鱼类替代（允许更精确的观察，避免非特定沉淀物沉积的最终问题）。
  4. 增加水洗的松紧度。
  5. 加入乙酰化步骤。

食谱

10x PBS（pH 7.4）储备溶液
1. 称取25.6g Na2HPO4·7h2O，80g NaCl，2g KCl，2g KH2Po4
2. 用毫厘H2O调高到1升
3. 高压灭菌器
4. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
1x PBST
1. 在1X PBS溶液中加入0.1%吐温-20
2. 在室温下储存，如果出现沉淀物/颗粒（瓶子可能已被污染），则丢弃
下摆缓冲
0.1 mHepes，pH值6.9
50毫米egta，ph值7.2
10毫米mgso4
新鲜的准备
cish固定缓冲液
3.7%甲醛加
0.4%戊二醛
1x PBS（pH 7.4）
新鲜的准备
鱼固定缓冲液
3.7%甲醛缓冲液
新鲜的准备
脱水缓冲液
50%1倍PBST
50%甲醇
新鲜的准备
补液缓冲液
50%甲醇
50%1倍PBST
新鲜的准备
渗透缓冲区
1X PBST中10μg/ml蛋白酶K
新鲜的准备
中和缓冲液
1X PBST中2 mg/ml甘氨酸
新鲜的准备
10倍茶原液
1. 在H2O中制备1m溶液
2. 将pH值调整到7.8
3. 不要高压灭菌
4. 小心喝茶（不要摇晃）
5. 在室温下储存，如果出现沉淀物/颗粒（瓶子可能已被污染），则丢弃
0.1米茶叶
用1X PBST稀释10X茶原液至0.1 M三乙醇胺（茶）
新鲜的准备
0.25%醋酸酐在0.1 m茶叶中
将0.25%醋酸酐（v/v）加入0.1 m茶溶液中，充分混合
新鲜的准备
再固定缓冲液
3.7%甲醛加0.2%戊二醛，1X PBST
新鲜的准备
8 m尿素储备溶液
1. 将尿素溶解在毫克H2O中，计算所需量（mW=60.06 g/mol）
2. 注意反应是吸热的
3. 新鲜制备，必要时过滤消毒
4. 该溶液可用于杂交和杂交后步骤，在这种情况下，保持在4°C
20x SSC（柠檬酸盐）储备缓冲液（1L）
注：20倍浓度的缓冲液可防止真菌和细菌生长。>
1. 将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）溶于900 ml毫质量H2O中。
2. 将pH值调整到7.0，顶部调整到1 L，并使用毫质量H2O
3. 高压灭菌器
4. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
20%十二烷基硫酸钠在低温下可能发生沉淀。在这种情况下，使用前先让缓冲区预热
尿素基杂交缓冲液
最终浓度：
5x子系统控制器
1%右旋糖酐
4 M尿素
50μg/ml肝素
50μg/ml的trna（或鲑鱼精子）
1%十二烷基硫酸钠
准备（10毫升）按以下顺序添加，新鲜准备：
2.5毫升20倍ssc
0.1g右旋糖酐粉末（溶解良好）
5ml 8m尿素储备溶液
25μl肝素（20 mg/ml储备）
10μl trna
5.1毫升毫克H2O
500μl 20%十二烷基硫酸钠
注：
1. 注意，过早添加十二烷基硫酸钠可能会导致出现沉淀。
2. 不要剧烈搅动，以免产生气泡。
3. 杂交缓冲液也可以在-20℃下校准和储存，在这种情况下避免多次解冻/冷冻循环。
50%杂交缓冲液
50%尿素基杂交缓冲液
50%1倍PBST
新鲜的准备
清洗i
最终浓度：
4 M尿素
0.1%吐温-20
5x子系统控制器
将milliq h2o加到体积中
新鲜制备；或在使用前不久（如使用前一晚）
清洗II
最终浓度：
2m尿素
0.1%吐温-20
2x子系统控制器
将milliq h2o加到体积中
准备新鲜的；或不久前（例如，使用前一晚）
清洗III
最终浓度：
0.1%吐温-20
2x子系统控制器
将milliq h2o加到体积中
新鲜制备；或在使用前不久（如使用前一晚）
10x单克隆抗体缓冲储备溶液
1. 加入700毫升的毫质量氢2o:116克马来酸、87克氯化钠、40克氢氧化钠
2. 小心地将pH值调整到7.5，并用毫厘H2O加满到1升
3. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
1x mAbt缓冲器
1. 以1:10稀释储备溶液，用毫厘H2O，加入0.1%吐温-20
2. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
10x封闭试剂储备溶液
1. 在马来酸缓冲液中溶解至最终浓度10%（w/v），摇动并加热至60°C
2. 原液应蒸压、校准并储存在-20°C下
1X闭锁缓冲器
5 m氯化钠
1. 将292 g NaCl溶于800 ml的Milliq H2O
2. 用毫厘H2O将音量调整到1L
3. 灭菌用高压灭菌器
4. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
1 M Tris HCl，pH 9.5
1. 将121.1g Tris碱溶于800ml的Milliq H2O中
2. 加入HCl调节pH至9.5（使溶液达到室温以精确调节pH）
3. 用毫厘H2O将音量调整到1L
4. 灭菌用高压灭菌器
5. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
1米mgcl2
1. 将203.3g mgcl2·6h2o溶解于800 ml的milliq h2o中
2. 调节音量至1升，毫质量h2o
3. 高压灭菌器
4. 室温储存，如果出现沉淀物/颗粒，则丢弃（瓶子可能已被污染）
ntmt缓冲区
最终浓度：
100毫米氯化钠
100毫米Tris HCl
50 mm的mgcl2
对于100毫升，添加：>
2毫升5 M氯化钠
10毫升1 M Tris HCl（pH 9.5）
5毫升1米氯化镁2
1毫升吐温-20
毫厘h2o体积
新鲜的准备
ntmt减去缓冲区
最终浓度：
100毫米氯化钠
100毫米Tris HCl
对于100毫升，添加：>
2毫升5 M氯化钠
10毫升1 M Tris HCl（pH 9.5）
1毫升吐温-20
毫厘h2o体积
新鲜的准备
ntmt缓冲区中的nbt/bcip
1. 添加到ntmt缓冲区：
  0.08 mg/ml硝基蓝四氮唑
  0.1 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐
2. 新鲜准备，避光

致谢

我感谢卢卡斯·莱克莱尔和伊夫林·霍利斯顿对手稿和讨论的评论，并感谢霍利斯顿/莫莫斯小组的其他成员，特别是桑德拉·切瓦利埃的讨论和协助。我也要感谢所有在他们的研究组织上测试这个方案的人，特别是冈萨洛·基罗加·阿蒂加斯、洛伦佐·里奇、丹尼尔·蒂尔。我感谢匿名评论者对手稿的有益评论。我也感谢恩里克·阿尔伯莱达对手稿的最终版本发表评论。资金来源：国家可再生能源机构，批准“Medusevo”ANR-13-PDOC-0016。