设备

计算机
能够访问网络的计算机。台式机或笔记本电脑可能更好地帮助复制和粘贴长DNA序列。在windows和mac计算机上测试。Linux计算机也应该兼容。

软件

indcaps工具（http://indcaps.kieber.cloudapps.unc.edu/“target=”\u blank“>http://indcaps.kieber.cloudapps.unc.edu/）

程序

筛选crispr/cas9等位基因的方法：
目标编辑位点的基因组序列，在预测切割位点的每一侧有30-40个碱基。crispr/cas9靶序列不需要与dna序列在同一个方向上，但它的排列必须使相邻的原间隔基序（pam）出现在所提供序列的右侧。例如，crispr/cas9靶序列ggttgagatcaagagaca将紧接ngg-pam以产生ggttgagatcaagaca>ngg。只应为这些工具提供目标序列（带下划线）。如图1所示，所需序列的一个示例。 < >
图1。筛选引物工具.< /强>用户可以在第一个文本框中输入他们的野生型序列，在第二个文本框中输入它们的CRISPR目标序列。在第三和第四个框中输入所需的最大不匹配次数和可接受的损失参数。单击蓝色的“高级选项”链接可以访问高级选项。

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未知crispr/cas9等位基因的引物设计

导航到indcaps主页面并检查第二个蓝色框。这个盒子的标签是“CRISPR/CAS9编辑事件的DCAPS筛选引物设计”。字段用示例序列填充。
将野生型基因组序列和crispr靶点复制到标记为“wt序列”和“crispr靶点序列”的字段中。复制的序列不应包含任何fasta标识符行（以字符开头）。
根据需要调整参数：
1. mismatch max：mismatch max参数影响报告的底漆中允许的不匹配碱基数量。如果超过此值，则拒绝底漆。失配值可以是零或任何正整数。
2. 可接受损失：这是用户希望通过此分析忽略的编辑事件的比例。indcaps工具模拟crispr突变过程，以产生一组预测的可能突变。在某些情况下，编辑的片段之一可能不是诊断片段。例如，drai在ttt^aaa网站上就直接删减了内容。考虑以下序列中drai站点的情况，其中插入或删除发生在符号：gctttaa aac处。单个碱基的删除或单个a的插入不会破坏限制位点，而g、c或t的插入将创建诊断位点。默认情况下，如果产生不确定位点的所有预测突变的比例超过10%，则该分析被拒绝。如果比例小于10%，则可以进行分析。如果用户不希望容忍遗漏的突变，将此参数设置为0将确保所有报告的分析都能找到所有预测的突变。
3. 扩增子长度：这将调整扩增片段的预期长度。indcaps工具检查它生成的引物的下游序列，以确保不存在与限制位置完全匹配的序列。例如，如果您在感兴趣的突变的每一侧提供150个碱基，那么在默认值为90个碱基的情况下，将只检查引物下游的90个碱基的限制位点。
4. 底漆类型：此二元选择决定底漆是按特定长度生成还是按特定熔化温度生成。默认为熔化温度。如果选择“长度”，则在生成底漆时忽略所需熔化温度的值（此项后面的A.3.F项）。同样，如果选择熔化温度，则在生成底漆时忽略所需的长度值（项目A.3.E）。
5. 底漆长度：如果底漆类型设置为“长度”，则所需的底漆长度。
6. 熔化温度：如果底漆类型设置为TM，则所需的熔化温度。
7. 允许3'G/T不匹配：默认情况下，indcaps忽略端子3'不匹配的任何引物。一些文献报道某些3'错配如G/T与PCR是相容的。要在底漆设计中允许这些不匹配，请将此参数设置为“是”。
8. 盐浓度：该值用于计算底漆的熔化温度。使用默认值50 mm。
9. 底漆浓度：该值用于计算底漆的熔化温度。使用默认值50 mm。
按“提交”。
检查输出：
1. 如果生成任何警告，它们将出现在输出页面顶部的项目符号列表中。警告可能表示输入中存在意外字符或DNA序列不够长。
2. 个别报告由一系列“=”符号分隔。
3. 有些报告可能会说“序列是反向的”，这意味着序列显示为用户提交内容的反向补充，并且相对于原始序列，引物是反向的引物。
4. 列出了酶的名称。
5. 接下来的两行指示是否检测到与当前限制性内切酶基序匹配的酶。括号中的值是基本位置，从显示序列的左侧开始计算。如果用户想要手动识别序列中限制基序的位置，则这些值非常有用。“可能的切割位点”是一个潜在的诊断位点，可用于caps或dcaps分析。“问题切割位点”与诊断位点上游的限制基序完全匹配。这些位点存在问题，因为它们在野生型和突变型等位基因中都会被切割，从而缩短了用于对序列进行基因分型的片段长度。由于引物中的不匹配，问题部位将被破坏，因此解决诊断序列的能力不会受损。
6. 接下来的两行表示用户提供的序列。
7. 下面的两行显示了与两个序列对齐的限制基序的位置以及由工具生成的对齐的引物。小写字母表示引向底漆的不匹配。
8. 如果发现问题站点，一系列“.”符号将与指示其位置的两个序列对齐。
9. 最后一行指示切割的顺序和底漆的估计熔化温度。
10. 示例输出如图2所示。
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图2。样本indcaps输出。这是对用户提供的序列的反向补充，显示了一个诊断引物，打算与acci限制性内切酶消化一起使用。提供的序列与已识别的限制性位点和建议的引物（包括任何不匹配）对齐。突变用红色方框表示。
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底漆选择标准：
所有技术上可能的检测报告都不考虑酶价或酶的可靠性，并且很难预测引物中的失配会对反应产生多大影响。在可能的情况下，建议使用caps分析，而不是dcaps分析，因为消化片段的大小差异通常更容易解决。
几个建议：
1. 如果使用DCAPS分析，请选择与3'端尽可能远的不匹配的引物。
2. 如果要同时执行多个DCAPS分析，则保存每个分析的所有结果非常有用。通过比较列表，您可以选择使用相同的廉价酶进行多个分析的引物，而不是为每个分析选择不同的昂贵酶。
3. 如果使用CAPS分析，用户也可以使用与诊断部位等距的引物，而不是与诊断部位邻接的建议引物。
一旦用户选择了一种分析方法，就应该选择第二种引物。indcaps工具检查当前酶基序的精确匹配是否在两个扩增子共享的区域中，但它不知道没有提供给该工具的序列。如果所需的放大倍数超出了所提供的序列，则用户应再次检查片段的其余部分是否没有完全匹配。
&中心有一系列退化基的限制基序，如bsli（ccnnnnngg）特别有用。如果crispr/cas9解理位点位于退化碱基的中间，则产生的indel常常改变cc/gg侧翼序列之间碱基的数目，导致消化反应失败。

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已知等位基因的基因分型：
包含突变和野生型等位基因的基因组序列。该序列应以感兴趣的突变为中心，每侧各有30-40个碱基，全长60-80个碱基。这两个序列在开始和结束时应该是相同的，唯一的区别是中间的兴趣突变。注：这两个序列可以根据需要更短或更长。如果序列太短，indcaps生成的底漆可能没有可接受的熔化温度，用户将不得不手动延长底漆。

已知等位基因分型的引物设计
1. 导航到Indcaps主页面，检查页面顶部的第一个蓝色框，如图3所示。盒子的标签是“已知等位基因的DCAPS引物设计”。字段用示例序列填充。
2. 将序列复制到标记为“第一序列”和“第二序列”的两个字段中。
3. 根据需要调整参数。这些参数与CRISPR/CAS9筛选工具所描述的参数相似，只是没有可接受的损失参数。
4. 按“提交”。
5. 输出和选择标准与CRISPR/CAS9工具的相同。
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  图3。已知等位基因工具。用户可以在前两个文本框中输入它们的两个序列，并在第三个框中指示它们期望的最大错配数目。单击蓝色的“高级选项”链接可访问高级选项。
  
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等基因突变事件筛选的引物设计
1. 这个工具，如图4所示，是为一个比较少见的用例而设计的，在这个用例中，crispr/cas9突变被用来分离一个与先前已知突变同基因的突变。在实践中，它的使用类似于已知的等位基因工具，其中caps/dcaps引物设计用于区分诊断部位的两个序列。在对引物进行评估以确定检测是否只检测到所需的突变的地方，采取了另一个步骤。
2. 导航到indcaps主页并检查第三个蓝色框，标记为“dcaps等基因突变事件筛选引物的设计”。
3. 将野生型和突变型序列复制到标记为“wt序列”和“突变序列”的字段中。
4. 将crispr/cas9目标序列复制到“crispr目标序列”字段中。此字段与筛选底漆工具中的相应字段具有相同的要求。
5. 根据需要调整参数。这些参数与CRISPR/CAS9筛选工具所描述的参数相似，只是没有可接受的损失参数。
6. 按“提交”。
7. 输出和选择标准与CRISPR/CAS9筛选工具的描述相同。
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  图4。用户可以在前两个文本框中输入他们的野生型和突变型序列，在第三个文本框中输入使用的CRISPR/CAS9目标序列。他们还可以在第四个和第五个文本框中指示他们期望的最大不匹配数和可接受的损失参数。单击蓝色的“高级选项”链接可访问高级选项。

数据分析

indcaps使用的算法在“indcaps：设计crispr/cas9突变事件筛选引物的工具”（Hodgens等人，2017年）中有描述，可在https://journals.plos.org/plosone/article？id=10.1371/journal.pone.0188406。

致谢

这项工作得到了国家科学基金（IOS1238051和IOS1455 607）以及美国农业部（2018—67013-26423）的资助。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的利益要申报。

工具书类

Hodgens，C.，Nimchuk，Z.L.和Kieber，J.J.（2017年）。indcaps：一种设计crispr/cas9突变事件筛选引物的工具。plos one12（11）：e0188406。
Neff，M.M.，Neff，J.D.，Chory，J.和Pepper，A.E.（1998年）。单核苷酸多态性遗传分析的一种简单技术dcaps：拟南芥遗传的实验应用。植物j14（3）：387-392。
Neff，M.M.，Turk，E.和Kalishman，M.（2002年）。用于单核苷酸多态性分析的基于web的引物设计。< >