图1.在存在H 2 O 2 和辣根过氧化物酶（HRP）的情况下，将红色从红色转换为试卤灵

材料和试剂

96孔微孔板，黑色，带盖的底部透明（Corning costar，目录号：3603）
60 mm培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
1.7 ml微量离心管
15 ml锥形管
微量移液器技巧
PluriStrainer 10μm（pluriSelect，目录号：43-50010-01）
血清移液器
秀丽隐杆线虫野生型N2菌株（明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传学中心）
大肠杆菌 OP50菌株（明尼苏达大学 Caenorhabditis 遗传学中心）
粪肠球菌 OG1RF株（ATCC 47077）
高压灭菌蒸馏水
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C-8503）
无水乙醇（Fisher，目录号：BP2818-4）
氯化钠（NaCl）（Fisher，目录号：S271-500）
蛋白ept（Becton，Dickinson and Company，目录号：211677）
琼脂（Becton，Dickinson and Company，目录号：214530）
氯化钙（CaCl 2 ）（EMD，目录号：3000）
硫酸镁（MgSO 4 ）（EMD，目录号：MX0070-1）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
一元磷酸钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
制霉菌素（EMD Millipore，目录号：475914-1GM）
硫酸庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G3632-5G）
辣根过氧化物酶（试剂盒的一部分：Invitrogen，目录号：A22188）
二甲基亚砜
Amplex ®红色过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒（Invitrogen，目录号：A22188）
过氧化氢（VWR，目录号：VW3540-2）
脑心输液粉（Becton，Dickinson and Company，目录号：211059）
Luria-Bertani粉末（Becton，Dickinson and Company，目录号：244620）
由庆大霉素（50μg/ ml）制成的脑心浸液（BHI）琼脂平板，由庆大霉素粉末加琼脂制成。浇注高压灭菌，冷却后的庆大霉素
由BHI粉末制成并经高压灭菌处理的脑心浸液（BHI）肉汤。
线虫生长培养基琼脂平板（请参见食谱）
M9W缓冲区（请参阅食谱）
50 mg / ml硫酸庆大霉素（请参阅食谱）
10毫克/毫升制霉菌素（见食谱）
5 mg / ml胆固醇（请参阅食谱）
磷酸钾缓冲液（1 M，pH 6.0）（请参见食谱）

设备

微量移液器
荧光和吸收酶标仪（Biotek，Cytation 5多模式读板机）
培养箱温度稳定； 20°C，25°C，37°C
台式离心机
立体显微镜（Zeiss，Stemi 2000）
涡旋混合器
高压灭菌器

软件

第5代（Biotek， https：// www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/ ）
Microsoft Excel（Microsoft， https://products.office.com/en-us/excel）
GraphPad Prism（GraphPad， https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

蠕虫同步和增长
1. 将10-15 N2野生型成虫从拥挤的非饥饿NGM板转移到新鲜的100 mm NGM板上。
2. 让蠕虫在20°C下过夜产卵。
3. 第二天，将所有蠕虫收集在5 ml M9W缓冲液中的板上。
4. 将蠕虫悬浮液通过10μmpluriStrainer过滤到50 ml锥形管中。仅L1级蠕虫可以通过过滤器。
5. 计算通过过滤器的L1级蠕虫的数量。
6. 将约500个L1阶段的蠕虫放在带有OP50细菌草坪的新鲜100毫米NGM琼脂平板上。
7. 在开始下一步之前，让蠕虫在20°C左右的L3后期到L4早期发育到36个小时，然后在下一步将需要蠕虫的幼年阶段。
E的制备。粪便板并控制 E。用于感染蠕虫的大肠杆菌板
1. 蠕虫到达正常阶段（成年幼虫）的前一天晚上，开始隔夜培养 E。粪便 OG1RF放入2 ml BHI肉汤和 E中。于37°C，在2 ml LB肉汤中加入大肠杆菌 OP50。
2. 加入400μl E。粪便培养到100 mm BHI琼脂平板中，其中含有50μg/ ml庆大霉素，并铺展形成草坪。庆大霉素可防止任何 E的生长。大肠杆菌随蠕虫一起转移，如 E。粪便本身具有抗性。在37°C下生长4-6小时。此外，添加400μl E。大肠杆菌培养至100 mm NGM琼脂平板，并在37°C下生长过夜。对于您要测试的每种条件，各制作一块板。
3. 删除 E。孵化器的粪便板，使其冷却至室温。
4. 加入5 ml M9W缓冲液，从NGM琼脂板上洗净蠕虫（成年阶段）。将悬浮的蠕虫转移到15 ml锥形管中。如有必要，使用额外的M9W缓冲液将剩余的蠕虫从板上洗净。
5. 让蠕虫沉降到试管底部，或以200 x g 的速度旋转一分钟。吸出液体，注意不要打扰收集的蠕虫。用M9W缓冲液清洗蠕虫两次。将蠕虫转移到 E。粪便（OG1RF）或对照 E。大肠杆菌（OP50）板。
6. 让平板在25°C下孵育过夜（约16小时）。这是暴露 C时使用的标准温度。线虫致病菌。
制备用于Amplex Red分析的试剂（足以进行20个反应）
1. 稀释Amplex ® Red分析试剂盒随附的5倍反应缓冲液，以制成总共25 ml的工作缓冲液。
2. 解冻辣根过氧化物酶（HRP）管，将等分100μl放入1.7 ml微量离心管中。然后，在微量离心管中，也应将一个试管再等分至20μl体积。保持20μl的体积可立即使用，并将其余的冻结在-20°C下。避免反复冻融。
3. 使用试剂盒随附的二甲基亚砜（DMSO），向试剂盒中提供的Amplex ® Red试剂（154 µg）中添加60μl并溶解。将溶解的试剂分装到1.7 ml微量离心管中的11μl体积中。留出一根试管以供立即使用，并将其余的管子冷冻在-20°C下。
4. 在准备开始测定之前，将试剂与以下体积一起添加：970μl1x反应缓冲液，20μlHRP，10μlAmplex ®红色。充分混合并在黑暗中保存，直到使用。
C的Amplex ® Red分析。线虫
1. 从 E上清除蠕虫。粪便和对照板，并使用1x反应缓冲液进行转移。
2. 将蠕虫收集在15 ml悬浮在反应缓冲液中的试管中。
3. 让蠕虫沉降到试管底部，或以200 x g 的速度旋转一分钟。吸出液体，注意不要打扰收集到的蠕虫。
4. 在1 ml反应缓冲液中将蠕虫清洗3-4次以除去细菌。
5. 对于每个样品，将1 ml蠕虫和反应缓冲液转移到60 mm空的培养皿中。切下移液器吸头的末端，使开口变大，然后在立体显微镜下观察，在25μl反应缓冲液中吸取约15个蠕虫，然后转移至96孔板的孔中。这样做两次以获得每50μl反应缓冲液/孔30 +/- 2个蠕虫。数动物并在必要时进行调整。再重复两次以生成样品的技术三份重复。
6. 按照Amplex ® Red试剂盒文献中的描述，在1x H 2 O 2 反应缓冲液中制备稀释液以形成标准曲线。我们使用0μM，1μM，2μM，3μM，4μM和5μM作为最终浓度。将50μl2x浓缩的H 2 O 2 标准品一式两份分配到96孔板中。加入相同体积的Amplex ®红色试剂混合物后，将达到所需的H 2 O 2 标准终浓度。建议H 2 O 2 标准孔应尽可能远离样品孔，以防止挥发性H 2 O 2 进入样品孔。
7. 混合Amplex ® Red试剂，HRP和缓冲液（步骤C4），并向蠕虫样品，对照和标准品的96孔板的每个孔中添加50μl。记录测定开始的时间。
读取/记录测定
使用酶标仪，使用540 +/- 20 nm激发和590 +/- 20 nm发射，底部光学元件位置和“扩展”增益读取荧光。我们使用带有Gen5软件的Biotek Cytation 5酶标仪来获取数据。测量值表示为相对荧光单位（RFU）。参见图2，该图是一个旨在测试蠕虫在非致病性（ E。coli OP50菌株和病原菌（ E。faecalis OG1RF菌株）为食物。以30、60、120和180分钟为准。通常，60分钟的读数显示出最佳的动态范围。

图2.样品板的组织和荧光读数。行“ A”具有H 2 O 2 用于创建标准曲线。 “ E”行具有样本的技术重复，蠕虫暴露于 E。大肠 OP50和 E。粪便中的OG1RF细菌。请注意，将样品放置在距离H 2 O 2 标准相对较远的孔中。将样品与Amplex Red试剂混合后60分钟读取读数。

数据分析

H 2 O 2 产生的量的计算
1. 通过减去0μMH 2 O 2 标准品（技术平均值的平均值）的测量值，计算样品的 RFU（rRFU）重复）。结果表示在测量的时间段内蠕虫在样品中生成的RFU。
2. 通过从测量值中减去0μMH 2 O 2 标准品（反应缓冲液的背景荧光）的测量值，计算标准品的 rRFU 所有标准。
3. 使用GraphPad Prism或类似软件绘制标准品的rRFU数据，以创建线性标准品曲线。有关使用GraphPad Prism创建的标准曲线示例，请参见图3。
4. 计算标准曲线方程式的斜率（m）和 y截距（b）（rRFU = m [H 2 O 2 ] + b）。 GraphPad Prism软件自动计算值。
5. 使用以下公式计算每个样品每分钟产生的H 2 O 2 量。 H 2 O 2 产生：
  
  注意：以下是上式的详细推导：H 2 O 2 浓度。
  每个孔中的H 2 O 2 浓度：
  
  每孔100μl体积产生的H 2 O 2 总量：
  
  H 2 O 2 生产率
  
  H 2 O 2 生产率
  
  图3.样品标准曲线和方程式。 A.绘制相对浓度的精制相对荧光单位（rRFU）。 B和C。最佳拟合线性曲线（B）和方程（C）由Graphpad Prism生成。
数据的统计分析

每个样本都有三个技术重复。 GraphPad Prism或类似软件用于分析数据。通过平均每个样品的H 2 O 2 产量（pmoles /分钟）来创建条形图。误差棒代表三个重复的平均值的标准误差（SEM）。在非病原性和致病性细菌存在下产生H 2 O 2 的样品条形图见图4。 E。大肠杆菌（OP50株）和 E。粪便（OG1RF）。
未配对的两尾 t 检验用于检验数据的统计显着性。
为了验证独立生物学重复的结果，应该在不同的日子使用独立批次的蠕虫重复至少三遍实验。根据我们的经验，在特定的一天，特定批次的蠕虫产生的ROS的确切量会有所不同，具体取决于发育时间和其他变量的细微差异。因此，对不同日期获得的实验值求平均值是不可行的。但是，模式是一致的。例如，在该实验中，动物暴露于 E。粪便总是比暴露于非致病性 E的动物产生更多的ROS。大肠杆菌。为了出版目的，如有必要，可以将代表性实验显示为原始数据，并在其中添加生物学重复品。

图4。示例条形图显示了H 2 O 2 产量。按每个样本以每分钟皮摩尔为单位。误差线代表每个样品的技术重复样品的平均值（SEM）的标准误差（ P = 0.0002）。

菜谱

50 mg / ml硫酸庆大霉素
将50 mg硫酸庆大霉素溶解在1 ml蒸馏水中，并在-20°C下保存
10毫克/毫升制霉菌素
将10毫克制霉菌素悬浮在1毫升100％乙醇中，并储存在4°C下
5 mg / ml胆固醇
将5 mg胆固醇溶于1 ml 100％乙醇中，并在室温下保存
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（每升）
1. 高压灭菌并冷却至50°C
  3克NaCl
  2.5克蛋白<< br /> 18克琼脂
  975毫升蒸馏水
2. 在以相同顺序搅拌的同时添加以下内容：
  25 ml磷酸钾缓冲液（1 M，pH 6.0）
  1毫升MgSO 4 （1 M）
  1毫升CaCl 2 （1 M）
  1毫升制霉菌素（10毫克/毫升）
  1毫升胆固醇（5毫克/毫升）
3. 将10毫升或25毫升NGM分别倒入60毫米或100毫米培养皿中。让板固化过夜
M9W缓冲器
3克KH 2 PO 4
6克Na 2 HPO 4
5克NaCl
1升蒸馏水
高压灭菌器
加入1 ml无菌MgSO 4 （1 M）
每升磷酸钾缓冲液（1 M，pH 6.0）
30.2克K 2 HPO 4
118.2 g的KH 2 PO 4
用蒸馏水将总体积升至1 L
高压灭菌并分配在50 ml锥形管中以备将来使用

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的资助，授予D. A.G。编号为R01AI076406。内容仅是作者的责任，并且代表美国国立卫生研究院的正式观点。还公认的是基于该协议的先前出版物（Chavez等人，2007和2009; Liu等人，2019; Tiller和Garsin，2014 ； van der Hoeven等，2015年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Aguirre，J.和Lambeth，J.D.（2010）。来自飞蝇的真菌以及它们告诉我们有关哺乳动物Nox功能的信息。 Free Radic Biol Med 49（9）：1342-1353。
Back，P.，De Vos，W.H.，Depuydt，G.G.，Matthijssens，F.，Vanfleteren，J.R. and Braeckman，B.P.（2012）。探索实时的体内发育和衰老的氧化还原生物学>秀丽隐杆线虫。自由基生物医学杂志 52（5）：850-859。＆nbsp;
Belousov，V. V.，Fradkov，A. F.，Lukyanov，K.A.，Staroverov，D.B.，Shakhbazov，K.S.，Terskikh，A.V.和Lukyanov，S.（2006）。针对细胞内过氧化氢的基因编码荧光指示剂。自然方法 3（4）：281-286。
Chavez，V.，Mohri-Shiomi，A.和Garsin，D.A.（2009）。 Ce-Duox1 / BLI-3生成活性氧作为中的一种保护性先天免疫机制。秀丽隐杆线虫。感染免疫 77（11）：4983-4989。
Chavez，V.，Mohri-Shiomi，A.，Maadani，A.，Vega，L.A.和Garsin，D.A.（2007）。 DAF-16介导的免疫需要氧化应激酶，这是由于秀丽隐杆线虫。遗传学 176（3）：1567-1577。＆nbsp;
Dikalov，S.I.和Harrison，D.G.（2014）。检测线粒体和细胞活性氧的方法。抗氧化氧化还原信号 20（2）：372-382。
华盛顿州爱登斯（Edens），西澳大利亚州沙林（Sharling），成克（G.），夏皮拉（R.Shapira），金克塔德（JM），李（Lee），爱丁斯（Edens），哈萨克斯坦（HA），唐（X.），苏拉德（Sullards），C。，弗莱厄蒂（Flaherty），德比（DB），贝尼安（Benian），通用汽车公司（GM）和Lambeth，JD（2001）。酪氨酸跨-与细胞吞噬细胞氧化酶亚基gp91phox具有同源性的多域氧化酶/过氧化物酶Duox催化细胞外基质的连接。 J Cell Biol 154（4）：879-891。
Ewald，C.Y.，Hourihan，J.M.，Bland，M.S.，Obieglo，C.，Katic，I.，Moronetti Mazzeo，L.E.，Alcedo，J.，Blackwell，T.K.和Hynes，N.E.（2017）。 NADPH氧化酶介导的氧化还原信号通过 C的备忘录1促进抗氧化应激和延长寿命。线虫。 Elife 6：e19493。
Knoefler，D.，Thamsen，M.，Koniczek，M.，Niemuth，N.J.，Diederich，A.K.和Jakob，U.（2012）。定量的体内氧化还原传感器发现氧化应激是生命中的早期事件 Mol Cell 47（5）：767-776。
Labuschagne，C. F.和Brenkman，A. B.（2013）。用于量化秀丽隐杆线虫和其他模型中ROS和氧化损伤的当前方法 Ageing Res Rev 12（4）：918-930。＆nbsp;
Liu Y，Kaval，K.G.，van Hoof，A.和Garsin，D.A.（2019）。血红素过氧化物酶HPX-2可保护秀丽隐杆线虫免受病原体侵害。 PLoS Genet 15（1）：e1007944。＆nbsp;
McCallum，K.C.和Garsin，D.A.（2016）。活性氧在调节秀丽隐杆线虫免疫应答中的作用。 PLoS Pathog 12（11）：e1005923。
Miranda-Vizuete，A.和Veal，E.A.（2017）。秀丽隐杆线虫作为理解ROS在生理和疾病中功能的模型。 Redox Biol 11：708-714。
Mohanty，J.G.，Jaffe，J.S.，Schulman，E.S。和Raible，D.G。（1997）。高度敏感二羟基苯恶嗪衍生物的荧光显微测定活化白细胞中H 2 O 2 的释放。免疫学方法 202（2））：133-141。＆nbsp;
H.Moribe，H.Konakawa，R.Koga，D.，Ushiki，T.，Nakamura，K.和Mekada，E.（2012）。在秀丽隐杆线虫中通过双重氧化酶系统生成活性氧物种需要四跨膜蛋白。 PLoS Genet 8（9）：e1002957。＆nbsp;
Pellegrino，M.W.，Nargund，A.M.，Kirienko，N.V.，Gillis，R.，Fiorese，C.J.和Haynes，C.M.（2014年）。线粒体UPR调节的先天免疫力可抵抗病原体感染。自然 516 （7531）：414-417。
Schulz，T. J.，Zarse，K.，Voigt，A.，Urban，N.，Birringer，M.和Ristow，M.（2007）。葡萄糖限制通过诱导线粒体呼吸和增加氧化作用，延长了线虫的寿命。细胞代谢 6（4）：280-293。
Sem，X.和Rhen，M.（2012年）。秀丽隐杆线虫中沙门氏菌的致病性

PLoS One 7（9）：e45417。
Tiller，G.R.和Garsin，D.A.（2014）。 SKPO-1过氧化物酶在皮下组织中的功能是保护秀丽隐杆线虫免受感染细菌感染。 Genetics 197（2）：515-526。
范德霍芬（R.van der Hoeven），克鲁斯（Mr.R.），查韦斯（V.）双重氧化酶BLI-3的定位及其在感染期间的NADPH氧化酶结构域的特征秀丽隐杆线虫。 PLoS One 10（4）：e0124091。