材料和试剂

A. 消耗品
1. 显微镜管（DELTALAB，目录号：4095.5N，4095.9N）。
2. 移液器吸头（DELTALAB，目录号：200072，200016）。
3. PCR微孔板96孔(Axygen，目录号：32165051)
4. 塑料杵(Sigma，目录号：Z359947)

B. 化工产品
1. Tris底座（BIOPACK，目录号：2000166800）。
2. 乙二胺四乙酸（EDTA）（BIOPACK，目录号：2000964500）。
3. 氯化钠(BIOPACK，目录号：2000164606)
4. 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Bio Basic INC，目录号：DB0108）；
5. β-巯基乙醇(BIOPACK，目录号：2000954500)
6. 氯仿(BIOPACK，目录号：2000165100)
7. 异戊醇(BIOPACK，目录号：2000972500)
8. 乙醇(BIOPACK，目录号：2000165400)
9. 醋酸钠(BIOPACK，目录号：2000168000)
10. RNase A (赛默飞世尔科技公司，目录号：EN0531)
11. 羔羊DNA/EcoRI+HindIII标记（Promega，目录号：G1731）。
12. 甘油(BIOPACK，目录号：2000162000)
13. 溴酚蓝(BIOPACK，目录号：2000962200)
14. 二甲苯氰醇FF（SIGMA，目录号：X4126）。
15. 硼酸(BIOPACK，目录号：2000935900)
16. 琼脂糖(TransGen公司，目录号：GS201)
17. UltraPureTM 溴化乙锭(赛默飞世尔科技公司，目录号：15585011)
18. EcoRI(新英格兰生物实验室，目录号：R0101S)
19. 牛血清白蛋白（BSA）（Promega，目录号：R3961）。
20. HpaII(新英格兰生物实验室，目录号：R0171S)
21. MspI(新英格兰生物实验室，目录号：R0106)
22. T4 DNA连接酶(Promega，目录号：M1801)
23. 寡核苷酸(表1)(IDT，Integrated DNA Technologies，Inc.，Iowa，USA)

表1.所用适配器和引物的序列。
寡核苷酸序列（5′-3′）
适配器
生态研究所 CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC。
HpaII/MspI GACGATGAGTCTCGAT
CGATCGAGACTCATC
预扩增引物
生态研究所+0 GACTGCGTACCAATTC
HpaII/MspI +1 ATGAGTCTCGATCGGA
扩增引物
生态研究所+3 6-FAM-GACTGCGTACCAATTC +3
HpaII/MspI +3 ATGAGTCTCGATCGGA +3。

24. Taq DNA聚合酶（赛默飞世尔科技公司，目录号：11615044）。
25. 氯化镁(赛默飞世尔科技公司，目录号：11615044)
26. dNTP套装（100mM）（赛默飞世尔科技公司，目录号：10297018）。
27. 高地甲酰胺（赛默飞世尔科技公司，目录号：4311320）。
28. GeneScan 500HD Rox尺寸标准（赛默飞世尔科技公司，目录号：401734）。
29. ddH2O(无菌)
30. 萃取缓冲液（见配方
31. TBE（Tris-Borate-EDTA）缓冲液（见配方）。
32. 6倍的DNA装载缓冲液（见配方）。

装备

1. 移液器(BOECO, Wheaton SOCOREX和Finnpipette)
2. Vortex(IKA，型号：MS1)
3. 超速离心机(Eppendorf，型号：5804R)
4. 恒温浴缸（Vicking，型号：Masson）。
5. 琼脂糖凝胶电泳系统（Bio-Rad实验室，型号：1645056）。
6. 微波炉(HITPLUS，型号：CM203M)
7. 分光光度计(AmpliQuant，型号：AQ-07)
8. 凝胶成像仪(Bio-Rad实验室，型号：Gel Doc 1000)
9. 孵化器(三洋，型号：MIR 262)
10. 热循环器Veriti 96孔（Applied Biosystems，型号：9902）。
11. 基因分析仪（Invitrogen，型号：ABI PRISM 3130）。
12. 超低温冷冻机-80 °C (Forma Scientific, 型号：8270)

軟件

1. GeneMapper v3.7.(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
2. R v2.15.1。(R统计计算基金会，奥地利维也纳)
3. RStudio v1.1.442 (RStudio Inc., Boston, MA, USA)

流程

A. DNA提取程序
1. 收集50-100毫克的叶组织在1.5毫升离心微管。将组织在液氮中闪冻，并用塑料杵研磨。
2. 加入300微升提取缓冲液，并通过涡旋（5-10秒）大力混合，使组织匀浆。孵育匀浆在65℃下30分钟，在恒温浴中。
3. 加入100微升氯仿:异戊醇(24:1)，通过倒置轻轻混合样品。
4. 将匀浆液在4℃下以20,800×g离心5分钟。
5. 通过使用200微升的微量吸管，小心地吸出水相，并将其转移到一个新的微管。
6. 加入500微升冰冷的乙醇:醋酸（24:1），倒置微管2-3次混合样品，沉淀DNA，在-20℃下静置30分钟。
7. 离心样品在20,800 xg，在4℃下离心10分钟，以形成一个DNA颗粒在微管的底部。
8. 弃去上清液，用100微升70%的乙醇清洗颗粒。涡旋管1分钟以清洗颗粒。
9. 将样品在室温下以15,300×g离心5分钟，并将微管倒置在纸巾上30分钟，直到乙醇完全蒸发，或将其置于干燥室中15分钟，让颗粒干燥。
10. 将DNA用RNase A（50 μg-ml-1）重悬于50 µl超纯水中。在室温下孵育30分钟。
11. 将DNA样品储存在4℃，直到使用。如果DNA长时间不使用，请将其保存在-20℃。
12. 通过在0.8％琼脂糖凝胶上装载2μl的DNA溶液，并在90 V下运行30分钟，检查提取的完整性和纯度。它应该显示一个高分子量的厚带，超过21Kbp，没有涂抹（图1）。
13. 在分光光度计中测量DNA样品的浓度，并制备约100 ng-μl-1的工作溶液。

图1.在0.8%琼脂糖凝胶中可视化的在0.8％琼脂糖凝胶中可视化的DNA样品的代表图像。

B. 用EcoRI消化
1. 根据样品的浓度，计算出对应700 ng DNA的样品体积。但要考虑到DNA浓度应高于40.5 ng-μl-1，否则会超过反应的最终体积。
2. 根据表2计算出样品总数所需的每种试剂的量。为了补偿移液误差，可以考虑在分析样品总数的基础上增加一个样品，这很方便。

表2.用EcoRI酶解的母液用EcoRI进行酶解的主混合物
试剂每个样本的微升
DNA（700纳克） X
缓冲区10倍 2
EcoRI 20 U/μl (NEB) 0.5
BSA 100x 0.2
超纯水 17.3 – x
最后一卷 20

3. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
4. 分布在各个管中的主混合，并加入DNA。通过倒置或轻弹管子（不要涡流）和离心机10秒，轻轻地均质。
5. 在37℃的培养箱中孵育过夜。
6. 如果您继续进行下一步，请将管子放在冰上。否则，将它们存储在冷冻室在-20℃，直到使用。

C. 用HpaII和MspI消化。
1. 对于上一个反应（B）的每支管子，将内容分配到两支管子中（每支管子中10μl），并在新管子上标上样品代码，在一支管子上加字母"H"，在另一支管子上加字母"M"。从现在开始，您将为每个分析样品使用两支试管。
2. 将准备两个母液混合液，只是在限制性酶上有所不同，一个用HpaII，另一个用MspI。对于这两个反应，根据表3计算出样品总数加一个的每个试剂的所需量。

表3.用HpaII和MspI进行酶解的母液。用HpaII和MspI进行酶解的母液。
母带H
试剂每个样本的微升
EcoRI消化系统 10
缓冲区1 10x 2
HpaII 10 U/μl (NEB) 1
BSA 100x 0.2
超纯水 6.8
最后一卷 20
主混音M
试剂每个样本的微升
EcoRI消化系统 10
缓冲区4 10x 2
MspI 20 U/μl (NEB) 0.5
BSA 100x 0.2
超纯水 7.3
最后一卷 20

3. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
4. 将母液H分配到标有字母"H"的试管中，将母液M分配到标有字母"M"的试管中。从现在起，每个样品将有两支试管。通过倒置或轻弹试管（不要涡流）轻轻地均质，并离心10秒。
5. 在37℃的培养箱中孵育过夜。
6. (可选)通过运行6μl的限制性产物在1.2％琼脂糖凝胶上，在90V下30分钟，检查这两个消化的效率。它应该显示一个微妙的涂抹从5100到100 bp（图2）。

图2.在1.2%琼脂糖凝胶中可视化的限制性产物的代表图像。在1.2％琼脂糖凝胶中可视化的限制性产物的代表图像。

7. 保持管在冰上，如果你将继续与下一步。否则，将它们存储在冷冻室在-20℃，直到使用。
D. 适配器结扎
1. 准备双链EcoRI和MspI/HpaII适配器从单链寡核苷酸通过添加等量的每个寡核苷酸在管（表1）。将管子放在热循环器中，并用热盖子运行ADAPTORS程序（表4）。

表4.PCR程序
适配器前期工作扩增废止
步骤时间 °T 步骤时间 °T 步骤时间 °T 步骤时间 °T
1 5分钟 95 °C 1 30 s 94 °C 1 30 s 94 °C 1 3分钟 90 °C
2 1分钟 94 °C 2 1分钟 56 °C 2 30 s 65 °C 2 ∞ 4 °C
3 转到步骤2 x69，每周期降低1℃。 3 1分钟 72 °C 3 1分钟 72 °C
4 转到步骤1x19 4 转到步骤1 x13，每周期降低0.7℃。

4 ∞ 4 °C 5 ∞ 4 °C
5 30 s 94 °C
6 30 s 56 °C
7 1分钟 72 °C
8 转到步骤5 x22
9 ∞ 4 °C

2. 根据表5，计算出样品总数加1的每种试剂的用量。

表5.结扎反应的母液结扎反应的母液
试剂每个样本的微升
消化 10
适配器 EcoRI 1.25
适配器MspI/HpaII 1.25
10倍连接酶缓冲液 2
T4连接酶3 U/μl (Promega) 0.25
超纯水 5.25
最后一卷 20

3. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
4. 分布在各个管中的主混合，并加入10μl的消化。通过倒置或轻弹管子（不要涡流）和离心机10秒轻轻均质。
5. 室温下孵育3小时。
6. 保持管在冰上，如果你将继续与下一步。否则，将它们存储在冷冻室在-20℃，直到使用。

E. 第一次放大(前置放大)
对于该PCR反应，使用与适配器相同序列的寡核苷酸加1个选择性核苷酸。这些寡核苷酸被确定为引物EcoRI+1和引物H/M+1(表1)。
1. 根据表6计算总样品所需的每个试剂的必要量，考虑到一个额外的样品，以补偿移液误差。

表6.用于预放大的主混音
试剂每个样本的微升
结扎 2
缓冲区10倍 2
MgCl2 50 mM 0.6
dNTPs 2 mM 1
Primer EcoRI +0 20 μM 0.2
底漆 H/M +1 20 μM 0.2
Taq聚合酶 5 U/μl (Invitrogen) 0.2
超纯水 13.8
最后一卷 20

2. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
3. 分布18微升的主混合在每个管中，并添加2微升的结扎。添加2微升的水到剩余的混合使用它作为阴性反应控制。通过倒置或轻弹（不要涡流）和离心机10秒轻轻均质。
4. 将样品加上阴性对照放入热循环器中，用热盖运行PREAMPLIFICATION程序（表4）。
5. 检查反应的效率，通过加载5μl的预扩增在1.2％琼脂糖凝胶和运行在90 V下30分钟。它应该显示一个强烈的涂片，从1500到100 bp的少数或一些弥漫带（图3）。

图3.预扩增产品的代表图像在1.2％琼脂糖凝胶中可视化的预扩增产品的代表图像。

6. 稀释预扩增1:3。如果继续进行下一步，请在冰上保存，或在-20℃的冷冻室中保存。预增剂可以安全地保存在冷冻室中几个月。

F. 第二次扩增（选择性扩增）。
对于该PCR反应，使用与适配器相同序列的寡核苷酸加上3个选择性核苷酸。这些寡核苷酸被确定为引物EcoRI +3和引物H/M +3（表1）。
1. 根据表7，计算出样品总数加1所需的每种试剂的必要量。

表7.扩增反应的母液扩增反应的母液
试剂每个样本的微升
预放大1:3 1
缓冲区10倍 1
MgCl2 50 mM 0.3
dNTPs 2 mM 0.5
Primer EcoRI +3 4 μM 0.5
底漆 H/M +3 20 μM 0.1
Taq聚合酶5U/μl
(Invitrogen) 0.05
超纯水 6.55
最后一卷 10

2. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
3. 在每个管中分配19微升的主混合液，并加入1微升的1:3稀释的预放大。对剩余的混合加入1微升的水，将其作为阴性反应对照。通过倒置或轻弹（不要涡流）和离心机10秒轻轻均质。
4. 放置在热循环器和运行AMPLIFICATION程序（表4）与热盖。
5. 检查反应的效率，通过加载5μl的扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶和运行在90 V 30分钟。根据引物组合，它应该显示一个涂片与扩散带从700到100 bp（图4）。

图4。在1.2％琼脂糖凝胶中可视化的扩增产物的代表图像。

6. 保持管在冰上，如果你继续与下一步，或存储在冷冻室在-20℃。荧光标记的扩增可以安全地存储在-20℃下至少6个月，保持其光发射。

G. 电泳
1. 根据表8计算总样品所需的每个试剂的必要量，考虑一个额外的样品，以补偿移液误差。

表8.扩增反应的母液。扩增反应的母液
试剂每个样本的微升
扩增 1
Hi-Di 甲酰胺 8.5
GeneScan 500HD ROX (Applied Biosystems) 0.5
最后一卷 10

2. 准备母液混合，通过涡旋（2-3秒）和离心机10秒均质。
3. 分布在96孔板的每个孔中的9微升的主混合，并加入1微升的扩增产物。
4. 将板子放在热循环器中，用热盖子运行程序DENATURATION（表4）。
5. 将盘子从热循环器中取出，放在冰上。
6. 将板放在ABI Prism 3,130 DNA测序仪（Applied Biosystems）中并运行。

数据分析

A. 等位基因调用和矩阵生成
1. 使用GeneMapper v3.7(Applied Biosystems)对所得电子图谱进行半自动评分。分析片段的长度范围为100～500 bp。GeneMapper中使用的参数的完整规格总结在(Cara et al., 2014)中。GeneMapper的报告管理器工具被用来只检索样品名称和等位基因列到逗号分隔值(.csv)文件中。
2. EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI消化液之间存在/不存在的模式被编码为0至3；然后，将此编码转换为二进制矩阵，以显示模式3、2或1的存在（1）或不存在（0）（图5）。模式0没有在二元矩阵中编码，因为EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI消化液中没有片段可能是由于外部胞嘧啶的甲基化或核苷酸序列的变化。下面的R脚本是为了进行这种分析而开发的。

用于生成MSAP二进制矩阵的R脚本。
##### R命令用于从Genemapper csv文件生成MSAP二进制矩阵。

## 下面的命令可以确保工作内存被清除。
rm(list = ls(all = TRUE))

## 设置工作目录（PATH将具体到数据所在的位置）。
setwd("C:/...")

## 读取数据集。输入文件应包含按行排列的样本和按列排列的位点，包括标题（位点名称）和第一列的样本名称。
## ＃＃每个被HpaII和MspI消化的样品都被标识为"SampleName_H"和"SampleName_M"，一前一后。
Data = read.csv("MSAP_Genemapper.csv", header=T, row.names = 1, check.names=F)

## 创建对象
out <- c()
MSAP_patterns <- matrix(nrow = dim(Data)[2], ncol = 0)

## 这是一个针对j个杂种和i个位点的双循环。它生成MSAP模式矩阵（0、1、2或3）。
for (j in 1:dim(Data)[1]) if (j %% 2 ==1)
{
for (i in 1:dim(Data)[2])
{
out <- append(out, ifelse(Data[j,i]+Data[j+1,i]==0, '0',
ifelse(Data[j,i]+Data[j+1,i]==2，'1'。
ifelse(Data[j,i]==1, '2', '3')))
}
MSAP_patterns <- cbind(MSAP_patterns, matrix(out, dimnames = list(colnames(Data), substr(row.names(Data)[j], 1, nchar(as.char.character(row.names(Data)[j]))-2)))
out <- c()
}

##这是一个循环，为i个位点创建一个二进制矩阵，显示每个模式的存在/不存在（1、2或3）。
dummies <- matrix(nrow = dim(MSAP_patterns)[2], ncol = 0)
for (i in 1:dim(MSAP_patterns)[1])
{
dummies <- cbind(dummies, matrix(as.numeric(MSAP_patterns[i,] == 1), dimnames = list(colnames(MSAP_patterns), paste(row.names(MSAP_patterns)[i], "1", sep = "_")), matrix(as.numeric(MSAP_patterns[i,]== 2), dimnames = list(colnames(MSAP_patterns), paste(row.名称(MSAP_patterns)[i], "2", sep = "_")), matrix(as.numeric(MSAP_patterns[i,] == 3), dimnames = list(colnames(MSAP_patterns)), paste(row.names(MSAP_patterns)[i], "3", sep = "_")))
}
binary_matrix <- dummies[,colSums(dummies !=0) !=0] 。

## 将输出保存到工作目录
write.csv(binary_matrix, file = "MSAP_binary_matrix.csv")

图5.甲基化敏感扩增多态性（MSAP）模式分析。甲基化敏感扩增多态性（MSAP）模式分析。A.从片段扩增图谱和DNA甲基化模式编码推断CCGG限制性位点的甲基化状态。黑色C代表甲基化的胞嘧啶。B.通过对特定甲基化模式的存在（1）或不存在（0）进行编码得到的二元矩阵。

B. 确定特定物种和新型碎片
1. 将在评估的天然杂交种中观察到的扩增模式与合成杂交种及其亲本基因型中获得的模式进行比较。合成杂交种中存在的片段被归类为S. microdontum或S. kurtzianum物种特异性。此外，在天然杂交种中评估了合成杂交种中是否存在新的扩增片段(即存在于杂交种中但不存在于亲本物种S. microdontum和S. kurtzianum的基因型中)。如果新的片段也存在于至少一个被评估的S. x rechei基因型中，则被归类为S. x rechei物种特异性，如果它们仅在合成杂交种中被观察到，则被归类为新颖性。为了进行这一分析，开发了以下R脚本。

用于分析杂交种中MSAP表位遗传的R脚本。
#### R命令用于分析Hybrids中MSAP表位继承。

## 下面的命令可以确保工作内存被清除。
rm(list = ls(all = TRUE))

## 设置工作目录（PATH将具体到数据所在的位置）。
setwd("C:/...")

## 读取数据集。数据的组织形式为：按行排列的样本和按列排列的位点。
Data = read.csv("MSAP_binary_matrix.csv", header=T, row.names = 1, check.names=F)

## 创建对象
out <- c()
results <- matrix(nrow = 4, ncol = 0)

## ＃＃这是一个双循环的j杂交和i位点。行数如下：1-5杂交种，6 S. kurtzianum (Parental1)，7 S. microdontum (Parental2)，7 S. microdontum (Parental2)。1-5个杂交种，6个S. kurtzianum (Parental1)，7个S. microdontum (Parental2)，8-15个S. x rechei (自然杂交种)。对这些数字的任何修改应适用于以下命令。
对于(j在1:5中)
{
for (i in 1:dim(Data)[2])
{
out <- append(out, ifelse(Data[j,i]>0 & Data[6,i]>0 & Data[7,i]==0 & sum(Data[8:15,i])==0, 'A', ## 片段仅由杂交种和S. kurtzianum共享
ifelse(Data[j,i]>0 & Data[6,i]=0 & Data[7,i]>0 & sum(Data[8:15,i])==0, 'B', ## 片段仅由杂交种和S. microdontum 共享
ifelse(Data[j,i]>0 & Data[6,i]==0 & Data[7,i]==0 & sum(Data[8:15,i])>0, 'C', ## 片段仅由杂交种和S. x rechei 共享
ifelse(Data[j,i]>0 & Data[6,i]==0 & Data[7,i]==0 & sum(Data[8:15,i])==0, 'D', 'E'))))## ＃＃混血儿特有的碎片
}

results <- cbind(results, matrix(table(out, exclude = "E"),dimnames = list(c("Kurtzianum", "Microdontum", "Rechei", "Hybrid"), row.names(Data)[j]))
out <- c()
}

##将混合数转化为百分比
百分比 <- t(results)/colSums(results)*100

## 将输出保存到工作目录
write.csv(percentages, file = "MSAP_Hybrids.csv")

## 一个基本的图形表示
barplot(t(百分比), horiz = TRUE, las=1, col = c("红", "蓝", "绿", "黄"))

食谱

1. 萃取缓冲液
100mM Tris-HCl (pH 8.0)
20mM EDTA (pH 8.0)
1.4M氯化钠
0.4% (v/v) β-巯基乙醇。
2%（w/v）CTAB
2. 1x TBE（Tris-Borate-EDTA）凝胶运行缓冲液
89mM Tris碱
89 mM 硼酸
2mM EDTA (pH 8.0)
3. 6x DNA装载缓冲液
30% (v/v) 甘油
0.25% (w/v) 溴酚蓝 (Bromophenol blue)
0.25% (w/v) 二甲苯氰醇 FF

笔记

准备所有的母液，先加入体积较大的，再加入体积较小的，将酶留在最后。

鸣谢

我们感谢 María Virginia Sanchez Puerta 博士对手稿的批判性阅读。这项工作是由Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica和阿根廷库约国立大学PICT 1243支持。这个协议是从我们以前的工作（卡拉 et al., 2019)。

竞争性利益

作者没有竞争利益。

参考文献

1. Camadro，E. L.、Erazzu，L. E.、Maune，J. F.和Bedogni，M. C.（2012年）。野生马铃薯物种问题的遗传方法。植物生物学（斯图加特）14(4)：543-554。
2. Cara，N.，Ferrer，M. S.，Masuelli，R. W.，Camadro，E. L. and Marfil，C. F.（2019）.Epigenetic consequences of interploidal hybridisation in synthetic and natural interspecific potato hybrids.New Phytol 222（4）：1981-1993.
3. Cara, N., Marfil, C. F., García Lampasona, S. C., Masuelli, R. W. (2014)。比较两种检测系统以揭示植物中的AFLP标记。Botany 92: 607-610.
4. Vos, P.、Hogers, R.、Bleeker, M.、Reijans, M.、van de Lee, T.、Hornes, M.、Frijters, A.、Pot, J.、Peleman, J.、Kuiper, M.等人（1995年）。AFLP：DNA指纹的新技术。Nucleic Acids Res 23(21): 4407-4414。