材料和试剂

康宁TM 96孔黑色聚苯乙烯微孔板（费舍尔，目录号：07-200-590）
5 ml离心管（VWR，目录号：10002-731）
聚苯乙烯培养管（VWR，货号：60818-703）
1毫升Norm- Ject 注射器（Fisher，目录号：1481725）
50 ml猎鹰管（Genesee Scientific，目录号：28-108）
24-Well平底板（Olympus，目录号：25-102）
96孔微孔板，透明（Greiner Bio-One，目录号：655801）
盆栽土壤（专业种植混合物，森格罗园艺），补充了Gnatrol WDG，马拉松（吡虫啉）和Osmocote 14-14-14肥料
野生型烟草本塞米纳种子（种子由玛莎·奥罗斯科·卡德纳斯博士友情提供；植物转化研究中心）
带有辅助质粒pMP90的根癌农杆菌GV3101菌株（Koncz 和Schell，1986；加利福尼亚大学河滨分校Meng Chen博士提供）
pRATIO3212-SMAX1质粒（Khosla 等，2020b ）
具有携带pBIN61-p19构建体的辅助质粒pMP90的根癌农杆菌菌株GV3101（Koncz 和Schell，1986）（Habibi et al。，2018）
抗生素类
硫酸庆大霉素（GoldBio ，目录号：G-400-10）

五水壮观霉素二盐酸盐（GoldBio ，目录号：S-140-5）

卡那霉素单硫酸盐（GoldBio ，目录号：K-120-10）

利福平（GoldBio ，目录号：R-120-1）

六水合氯化镁（MgCl 2 ·6H 2 O）（Fisher，目录号：14222322）
2-（N-Morpholino）乙磺酸（MES）（Fisher，目录号：BP300100）
氢氧化钾（KOH）（Fisher，目录号：P250-500）
乙酰丁香酮（Fisher，目录号：AC115540010）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher，目录号：BP231-100）
Luria-Bertani（LB）汤（Fisher，目录号：BP9723-2）
细菌琼脂（Sigma，目录号：A5306-1KG）
含1.5％（w / v）琼脂的固体LB板
1 韩元
KAR 2
RAC -GR24
丙酮
MgCl 2 （100万库存）（请参阅食谱）
MES（50万库存）（请参阅食谱）
乙酰丁香酮（1 百万库存）（请参阅食谱）
渗透缓冲液（请参阅食谱）
KAR 1 ，KAR 2 ，rac -GR24（50 mM库存）（请参阅食谱）
笔记：

如先前报道的那样合成KAR 2 （Goddard-Borger等，2007）。外消旋GR24是根据合成Mangus 等人。然后用乙醚/己烷重结晶（Mangnus 等，1992）。
这些化学品可以从几个商业供应商处购买：KAR 1 ：Toronto Research Chemicals（M305480），Chiralix （CX27716）；KAR 2 ：Toronto Research Chemicals（F864800），Chiralix （CX94877）；RAC-GR24：Chiralix （CX23880），Strigolab （ST23b RAC ），PhytoTech 实验室（G3324），多伦多研究化工（S687590）
10 µM的化学药品库存（请参阅食谱）
0.02％（v / v）丙酮对照（请参阅食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5804 R）
30 °C培养箱振荡器（ThermoFisher ，型号：MaxQ 6000 R）
CLARIOstar 酶标仪（BMG Labtech）
4毫米圆形票务冲床
杜蒙＃5精细镊子（精细科学工具，目录号：11252-20）
1 mm电穿孔比色杯（Genesee Scientific，目录号：40-100）
MicroPulser 电穿孔仪（Bio-Rad，目录号：165-2100）
真空驱动的过滤器系统（奥林巴斯，目录号：25-227）
3.5英寸方形塑料罐（法朗（Farrand），目录号：K0-25SQ-G）

软件

Prism（v8.2.0，GraphPad Software Inc.）

程序

转化根癌农杆菌
通过电穿孔方法将pRATIO3212-SMAX1转化成根癌土壤杆菌菌株GV3101 （Mersereau 等，1990）。
在LB琼脂平板上选择转化体[ 含有50 µg / ml壮观霉素（表达构建体），25 µg / ml庆大霉素（辅助质粒）和25 µg / ml利福平（基因组）]，在30°C下放置2-3天。

传播烟草本塞姆氏
在一个3.5英寸见方的塑料盆中发芽〜50-100个种子，该盆中的盆栽土壤处于〜21-24°C和16 h光照/ 8 h暗光周期，光照强度为〜80-100μmol / m 2 s。用塑料盖盖锅，以确保高湿度。
当第一片真叶出现后（10-12天），将幼苗转移到装有盆栽土壤的3.5英寸塑料盆中（每盆两棵幼苗），并用塑料盖再次覆盖4天。取下盖子并保持上述生长条件。
每隔第二天或根据需要浇水。
移植后的3-3.5周，植物重新适应了农杆菌浸润的最佳发育阶段。
注意：最好在渗透前一天停止给植物浇水。

瞬态表达
在含有25 µg / ml庆大霉素（辅助质粒），25 µg / ml利福平（基因组），50 µg / ml大观霉素的2-3 ml液体LB培养基中培养携带pRATIO3212-SMAX1或pBIN61-p19（以下称为p19）的根癌农杆菌（pRATIO3212-SMAX1），50 µg / ml卡那霉素（p19）；在30°C的培养箱中以200-220 rpm的速度过夜生长。
笔记：

p19的存在部分阻断了RNA沉默，因此建立了更高，更均匀的转基因表达。
对于每个转化菌株，通过将0.5 ml培养物与0.5 ml 50％甘油混合来制备甘油储备液。储存在-80 °C 。
在50 ml Falcon管中的15 ml LB +抗生素中稀释1：1000的发酵剂培养物。在30°C的培养箱中以200 -220 rpm生长过夜。
注意：晚上执行此步骤。可以根据预期的转化数量来扩大培养量。但是，我们建议在50 ml的Falcon管中将培养物的体积保持在30 ml以下，以便正确通气。

在3900沉淀细胞XG ，在室温下，去上清，10分钟加入10 mL浸润培养基（见ř ecipes）重悬。
重复步骤C 3，将沉淀的细胞重悬于3-4 ml浸润培养基中。
注意：这些洗涤物去除了可能渗入后杀死叶片组织的抗生素痕迹。

在600 nm处测量培养物的吸光度。将100 µl 农杆菌培养物添加到一个干净的96孔板中，并使用酶标仪测量600 nm（OD 600 ）处的光密度。
笔记：

用含有浸润介质的孔将平板读数器空白，并使用空白的减去的OD 600 读数进行进一步计算。
或者，可以使用分光光度计在1 ml塑料比色杯中测量OD 600 。
确定渗透所需的培养物滴度，并计算最终转化液在渗透培养基中的最终体积为4.0-5.0 ml的稀释因子，具体取决于预期的转化次数。例如，如果您需要的最终OD600为0.6，并且培养物的读数为1.5，那么您将需要初始体积=（最终OD600 x最终体积）/初始OD600。因此，所需的初始体积=（0.6 x 4 ml）/1.5 = 1.6 ml。
注意：在此方案中，将SMAX1和p19分别稀释至OD 600 的0.6和0.4，最终浸入体积为4.0 ml。但是，其他蛋白质的最佳比例可能有所不同。最终的OD 600 不应超过1.2，因为这会引起组织坏死，而另一方面，OD 600 为0.3或更低会大大降低瞬时表达效率（Kim等，2009）（请参见注释1）。

涡旋并在室温下孵育培养物4小时（不摇动）。
选择合适的叶子进行渗透。选择外观最健康的植物，并避免叶片被撕裂或损坏。理想的叶子是约3-5厘米宽的幼叶。每个植物使用2-3片叶子，每个构建体至少使用3片叶子（来自独立植物）。
笔记：

烟草本生植物的发育阶段对于该方法的成功至关重要。健康的植物至少应有两片大叶，它们可能是顶端分生组织的第三片或第四片叶子。
避免使用小叶片，因为它们很难渗透并且显示出较低的转化率。
渗透时，植物不应开花。
在将溶液吸入注射器之前，先将溶液在试管中旋转，以使农杆菌均匀悬浮。将没有针头的1 ml注射器的喷嘴按在叶片的背面（下）表面，并在另一侧握住戴手套的手指，然后缓慢注射。注射时尽量保持柔和，以免损坏叶片。浸润区域显示为深色的水浸区域。如果渗透区域停止扩张而没有用力推动，则再次渗透到叶片的其他区域。渗透后，用Kimwipe轻拍干燥叶子表面，并用Sharpie永久性标记物标记渗透圆的边缘。通过在叶柄上附加一个小标签来标记叶子。
笔记：

（ø ptional）浸润之前，小切口，可以在渗透的使用无菌剃刀现场制成。确保伤口没有在叶子上打孔，这可能会降低渗透效率。
我们通常每片叶子不渗透超过一个构建体。
不必渗入总的叶子空间。我们通常在单片叶子中浸入2-3个斑点。
如果要在同一棵植物上渗入不同结构的叶子，则应在两次渗入之间用70％的乙醇清洁手套（或用Kimwipe擦拭它们），并确保叶子彼此不接触，以防止交叉污染。
我们建议使用仅用p19转化的叶子（未转化的叶子更不可取）作为阴性对照。
返回渗透N. 本生植物生长室，水他们，并培育3天正常生长条件下。

降解测定
在设置处理板之前，有必要验证报告蛋白的表达。
准备一个黑色的96孔板（低自发荧光），并添加300微升卫生署2 Ø在你要使用的水井。使用打孔器从每片已转化（仅p19或未转化）叶片中切出单个叶片盘，并将其置于微板的背面（即叶片下侧）朝上。读板按E节鉴定那些表现出转化超过P19（或未转化的）信号的良好比叶，并用这些样品进行（小号EE 注2 和3）。
注意：此步骤对于确定适合降解测定的叶片（S teps D 3- D 6）至关重要。

准备一个用于样品收集和处理的24孔处理板（图1）。标记孔，并在每个孔中加入1 ml新鲜制备的10 µM KAR 1 ，KAR 2 ，rac -GR24或0.02％（v / v）丙酮对照（请参见第9条）。
每次处理从渗透区域/圆形内每片叶片摘取5片或6片叶盘，并在化学处理中使其漂浮（背面朝下）。在每个孔中放置不超过4个光盘。
笔记：

至关重要的是，在搬运过程中尽量减少对叶片的机械损坏（干净地打磨圆盘边缘，并尝试避免损坏镊子）。从切除的椎间盘中排除大静脉。
对于每种构建体，我们建议使用至少3棵来自独立植物的不同叶片。此外，每次处理应包括多个阴性对照叶片。
对于每片叶子，从中脉两侧的叶片随机打出叶子圆盘。当收集到所需数量的叶盘后，立即将它们随机转移到处理板上以防止它们干燥。或者，将光盘放入蒸馏水中，直到准备好传输为止。
对于每种构建体，将来自同一叶的圆盘随机分配给不同的处理，而不是将一个叶子的圆盘分配给一个处理，将另一叶子的圆盘分配给不同的处理。
盖好板并在室温下孵育12-16小时。
注意：应将板小心放置在实验室抽屉中（在黑暗中），不要将其留在工作台上。

设置用300μl卫生署黑色96孔微量培养板2 ○在每个孔中使用。每孔转移一张叶片圆盘（背面朝上）进行测量。
笔记：

丢弃看起来半透明（浸满水）或经过过夜处理后浸没的叶片。
必须在每个板上包括阴性对照（仅p19或未转化），因为需要以相同的增益进行测量以正确执行背景扣除。

图1的工作流程比例SMAX1丰度的测量烟草本塞姆氏。使用pRATIO3212-SMAX1 比率报告系统进行降解的示意图。

荧光强度定量
我们建议在CLARIOstar读板器上使用以下优化设置来测量mScarlet -I和Venus荧光。

注意：可以将这些设置与其他双荧光pRATIO 报告基因一起使用（Khosla 等，2020a ）。

基本设置
测量方法：荧光强度
读取方式：扫孔
微孔板类型：CLARIOstar 软件包含一个数据库，其中包含大多数微孔板制造商的微孔板尺寸。在这种情况下，我们从下拉菜单中选择“ COSTAR BLACK 96”。
注意：为了测量荧光，我们建议使用黑色板，因为它们吸收光并减少背景和串扰。

井扫描设置
注意：孔扫描以矩阵样式测量孔的不同点。输出是所有扫描点的平均测量值。

每个扫描点的闪烁次数：8
注意：对于使用pRATIO 记者进行荧光测量，通常8至10次闪烁即可。闪烁次数的增加也会增加读取时间。

扫描方式：矩阵扫描
扫描矩阵尺寸：9 x 9
注意：您可以使用此选项来定义扫描过程的矩阵大小，从而定义测量（扫描）点的数量。

扫描宽度[mm]：4
注意：此值经过优化以减少边缘效应（请参见注释3）

光学设置
注意：我们使用光谱扫描来确定每种荧光蛋白（FP）的激发和发射波长，这些荧光蛋白在烟叶的背景自发荧光之上产生最强的信号（表1）（Khosla 等，2020a ）。

表1. 烟草的最佳过滤器设置

没有。

FP

励磁

二向色滤光片

排放

获得

1个

mScarlet -I

560-10

573.5

595-10

调整后

2

金星

497-15

517.2

540-20

调整后

增益调整：对于每种荧光团，我们在测量前在整个板上进行了自动增益调整。仪器找到强度最高的井并确定适当的增益。
笔记：

增益调整的目的是优化信号放大，以使结果具有最大的灵敏度和动态范围。
对于来自同一阱的每个信号，最好具有最高的增益。
焦距[mm]：以最佳增益（如上所示）在孔上自动调整焦距。对于浮动在300的光盘μ升的水，这通常是-13毫米。
常规设置
光学：使用的顶部光学

注意：顶部读数取决于测量孔上方的反射光。对于我们的协议，我们希望顶部读数比底部读数更敏感。在96孔微孔板中的水上漂浮的叶片圆盘可确保它们不会被浸湿，而是坐在正确的高度以进行准确的测量。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003140--1500 AashimaKhosla 879734 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 烟草中SMAX1降解的比例检测。A. pRATIO3212-SMAX1 比率报告系统的示意图。在35S启动一个的启动子驱动表达的多顺反编码SMAX1-mScarlet-I融合被分开金星荧光蛋白翻译的转录物由于* F2A肽。在pRATIO3212系统在烟草和处理过夜，用10瞬时表达后的SMAX1 B.相对荧光μM KAR 1 ，KAR 2 ，外消旋-GR24，或0.02％（V / V）ACET 一个控制。n = 5-6个叶盘。* P <0.01，Mann-Whitney U检验与对照治疗的比较。所示数据代表三片独立叶片中的一片叶片，结果相似。

数据分析

通过以下四个步骤对数据进行规范化。
将mScarlet -I检测设置获得的荧光信号取平均值，该荧光设置用于携带p19（或未转化）的农杆菌转化的阴性对照叶圆片。同样，取含有p19（或未转化）叶盘的孔中的金星荧光值的平均值。这两个值代表每个报告基因的叶片自发荧光贡献的背景信号。
从微孔板上为每个样品孔获得的mScarlet -I信号中减去mScarlet -I背景值。
从微孔板上为每个样品孔获得的金星信号中减去金星背景值。
使用以下公式计算荧光强度：（[ mScarlet -I信号] -[ mScalrlet -I背景]）/（[[Venus信号]-[Venus背景]）。后用10 12小时治疗μM KAR 1 ，KAR 2 ，或外消旋-GR24，我们观察到> 在2倍下降mScarlet -I /金星比响应于所有三种治疗，表明SMAX1（图2的劣化，补充文件1）。
Prism（v8.2.0，GraphPad Software Inc.）用于执行数据可视化和统计分析。箱须图的中心线表示中位数，而彩色框表示四分位间距。晶须下降到最小值，然后上升到最大值，每个单独的值描绘为一个叠加在图形上的点。

笔记

p19 GV3101株
如果要共表达多种蛋白质，建议将pRATIO 构建体转化为已经带有p19的GV3101菌株。这使用于渗透的农杆菌的量最小化。与混合几种细菌相比，它还可以减少变异。

我们不建议使用显示mScarlet -I / Venus比小于0.3的叶子进行降解分析。要计算mScarlet -I /金星比，请使用负控制叶对每个mScarlet -I和金星进行信号归一化以执行背景归一化（请参阅“数据分析”部分）。
在此步骤中确定的增益和焦距设置必须与在过夜化学处理后读取光盘时使用的设置相同。
其他pRATIO 载体的兼容性
尽管我们在本研究中以pRATIO3212 比例系统为例，但该协议在包含烟草和拟南芥原生质体瞬时分析的含有生物发光报告基因的pRATIO 载体上同样有效（Khosla 等人，2020a ）。当使用生物发光报告分子时，我们建议使用白色或灰色板，因为它们反射光，这将使光输出信号最大化。

不同阅读模式的比较
在此协议中，我们使用孔扫描模式测量了荧光。除了进行良好的扫描外，CLARIOstar 还可以使用终点，轨道和螺旋平均模式来测量荧光强度。中心端点读数仅在井中心激发并测量，并给出一个数字。由于光盘可能会在两个时间点之间移动，因此可能导致错误。当使用螺旋和轨道平均模式时，读板器在定义的轨道上对每个孔进行多次测量，得出整个孔区域的平均数。孔扫描以矩阵样式测量孔的不同点。尽管螺旋平均和阱扫描都能产生可比的灵敏度，但是阱扫描功能更强大，因为它可以提供来自单个扫描点的原始数据值。还可以定义阈值以排除对所有孔均有效的扫描点。此外，叶盘收割有时可能会导致边缘损坏，从而导致较高的背景信号。使用扫描模式，您可以定义直径，例如将测量具有定义直径的圆内的测量点，从而排除潜在的不准确读数。但是，一个限制是，井扫描比轨道或螺旋平均模式慢。

执行时程分析
我们的协议也适合进行时程学习。要检查降解的时间过程，请设置一个黑色的96孔微孔板，进行300 µl化学处理，然后每孔转移一个叶片，背面朝上。至少使用12个叶盘（每片4片x 3片叶子）。带有螺旋平均选项的平板模式（慢动力学）在指定的时间点测量相对荧光。将循环数定义为将测量整个印版的次数和循环时间，即在一个循环中测量印版所需的时间。例如，如果您希望每小时每15分钟读取一块板6小时，那么循环时间将为300 s，循环次数为24。但是，在进行较长时间的过程实验时，可能会有一些限制（ > 6 h）使用此方法，最重要的是叶圆片沉入孔的底部，因此降低了顶部读取酶标仪的测量效率。或者，如本研究中所述进行测定。在指定的时间点，将光盘转移到96孔板中进行荧光测量，然后将其返回到24孔处理板中，直到下一个时间点为止。小心处理对于最大程度地减少光盘损坏至关重要。

菜谱

MgCl 2 （100万库存）
溶解101.65 g MgCl 2· 6H 2 ö在400ml去离子水中的2 ö
用去离子水将体积调节至0.5 L
真空过滤除菌
MES（50万库存）
在200 ml去离子水中溶解19.52 g MES
用1 N KOH调节至pH 5.7
真空过滤除菌
乙酰丁香酮（100万库存）
将0.196 g 乙酰丁香酮溶解在1 ml DMSO中
分为一次性使用的等分试样，在-20 °C下储存
渗透缓冲液
注意：渗透当天，应从储备溶液中新鲜制成渗透介质，并保持在室温直至需要。

10毫米MgCl 2

10毫米MES

150 μM 乙酰丁香酮

KAR 1 （50 mM库存）
将3.75 mg KAR 1 溶解在500 µl丙酮中，并储存在-20 °C下。

KAR 2 （50 mM库存）
将3.4 mg KAR 2 溶于500 µl丙酮中，并储存在-20 °C下。

rac -GR24（50毫米库存）
将7.45 mg rac -GR24溶于500 µl丙酮中，并储存在-20 °C下。

注意：在储存过程中，丙酮库存（5-7）可能会蒸发，因此我们使用带有螺纹盖的琥珀色玻璃小瓶并用Parafilm包裹小瓶以进行长期保存。打开之前，让试管升温至室温，以避免引入大气水分，这会水解GR24。

10 µM的工作化学储备液（新鲜配制）
2 µl 50 mM库存

稀9 ，998微升卫生署2 ö

0.02％（v / v）丙酮对照（新鲜配制）
2微升丙酮

稀9 ，998微升卫生署2 ö

致谢

该协议是Khosla 等人中描述的协议的详细扩展。，2020b 。非常感谢NSF IOS-1737153和NSF IOS-1740560向D CN的资金支持。我们感谢Gavin Flematti 博士和Adrian Scaffidi 博士（西澳大利亚大学）为KAR 和rac -GR24 进行化学合成和纯化。我们感谢Mark Waters博士（西澳大利亚大学）对本协议的早期草案提供了宝贵的反馈。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考文献

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