材料和试剂
玻璃巴氏移液器（Neta Scientific，目录号：7095B-9 ）
微量离心管适配器（GL Sciences，目录号：501021514）
3M EMPORE TM 固相萃取磁盘Ç 18 （CDS分析，目录号：98-0604-0218-1）
Hypercarb ® 30-40微米碳150-300埃物（Thermo Scientific，目录号：60106-402）
熔融石英毛细管75μm的ID X 363微米OD（Molex公司（Polymicro ），目录号：TSP075375）
1.7 ml微量离心管，Posi-click（Denville，目录号：C2170）
15和50 ml锥形离心管（Falcon，目录号：352196，352070 ）
TipP1000、200、20 和10移液器的吸头（USA Scientific）
MS样品瓶，LaPhaPack ，Snap，12 x 32 mm（LEAP PAL零件，目录号：LAP.11190933）
MS样品瓶Snap Cap，PE，Natural，Pre-Slit（LEAP PAL零件，目录号：LPP.011-03-8303）
Deep Well，96孔微孔板，2.0毫升（Thomas Scientific，目录号：89237526）
96孔板，V型底部600 µl（Axygen ，目录号：P-DW-500-CS）
96孔平底板（Fisher Scientific，目录号：12565501）
用于96孔PCR微孔板的密封垫（Axygen ，目录号：14-222-024）
Reprosil-Pur 120 C 18 -AQ 3 µm，3 g（ESI Source Solutions，r13.aq.0003）
10倍不含Ca 2+ / Mg 2+的Dulbecco PBS （Mediatech ，目录号：MT21031CM）
细胞解离缓冲液（Thermo F 清洗器，目录号：13151014）
NP-40 Alternative（Sigma-Millipore，目录号：492016）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Millipore，目录号：111474）
AEBSF（Sigma-Millipore，目录号：101500）
微囊藻毒素（Sigma-Millipore，目录号：475818）
丁酸钠（Sigma-Millipore，目录号：817500）
硫酸（H 2 SO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：A484-212）
三氯乙酸（Fisher Scientific，目录号：A322-100）
丙酮（Fisher Scientific公司，目录号：A18-500），小号撕在20℃下
盐酸（HCl）中（Fisher Scientific公司，目录号：A144S-500 ）
碳酸氢铵（NH 4 HCO 3 ）（Fisher Scientific，目录号：A643-500）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Millipore，目录号：A7906-100G）
考马斯亮蓝G-250（Fisher Scientific，目录号：BP100-25）
乙腈，Optima LC / MS级（Fisher Scientific，目录号：A955-1）
丙酸酐（Sigma-Millipore，目录号：8006080100）
氢氧化铵（Fisher Scientific，目录号：A669S-500）
改良胰蛋白酶，测序等级（Fisher Scientific，目录号：PRV5113）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：18-602-907）
三氟乙酸，Optima LC / MS级（Fisher Scientific，目录号：A116-05AMP）
甲酸，最佳LC / MS等级（Fisher Scientific，目录号：A117-50）
水，最佳LC / MS级（Fisher Scientific，目录号：W6-4）
甲醇，最佳LC / MS级（Fisher Scientific，目录号：A456-4）
胰蛋白酶消化的BSA MS标准品（经CAM修改）（New England Biolabs，目录号：P8108S）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号BP358-1）
氯化钾（KCl ）（Fisher Scientific，目录号：AC424090250）
氯化镁（MgCl 2 ）（Fisher Scientific，目录号：AC223211000）
氯化钙（氯化钙2 ）（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：C79-500）
核隔离缓冲液（NIB-250）（请参阅食谱）
NP-40替代品（请参阅食谱）
蛋白酶抑制剂（请参阅食谱）
磷酸酶抑制剂（参见食谱）
HDAC抑制剂（请参阅食谱）
0.2 M（0.4 N）硫酸（请参阅食谱）
ddH 2 O中的100％三氯乙酸（TCA）（w / v）（请参阅食谱）
丙酮+ 0.1％盐酸（参见配方）
100 mM碳酸氢铵（请参阅食谱）
注意：避免直接接触试剂和研究材料；始终使用手套和其他适当的个人防护设备（PPE）。使用自动移液器以防止意外摄入。
液氮：使用前需要培训。分配时请使用面罩，低温手套，低温围裙和脚趾封闭鞋。
H 2 SO 4 ，TCA，HCl和乙酸是腐蚀性酸。始终在化学通风橱中打开浓酸储备瓶，以免吸入烟雾。开放稀酸在一个通风良好的工作区。
氢氧化铵是强碱，也应在通风橱中使用以避免吸入烟雾。
丙酮，乙腈和甲醇易燃。使用火灾隐患的预防措施。采取标准的暴露预防措施。将所有含丙酮的试剂储存在-20 °C中。它也是强有机溶剂，会浸出聚苯乙烯移液器。使用玻璃移液器进行分配。
丙酸酐是刺激性的，具有腐蚀性。与大气接触会降解，因此将其存储在氩气下。充入氩气时，暴露量可能更高。打顶时，除了手套和实验室外套外，还要使用面罩和护目镜。注意：这是DEA控制的主导物质，需要获得批准，不能立即交货。
压缩气体（氮气，氩气）：需要进行适当的固定和安全处理培训。也可以使用氩气喷雾罐代替14 L罐。

设备
-80°C冷冻室
Hypersep 墨盒（Thermo Scientific，目录号：60109-404）
陶瓷刻痕晶片（Restek ，目录号：20116）
Pipetman ，P1000、200、20和10（Rainin ）
冷离心机（700 xg - 18,000 xg ）（NuAire ，型号：Nuwind ，目录号：NU-C200V）
氩气（空气，货号：AR HP 300 ）
氮气（空气，货号：NI UHP300 ）
杜恩斯组织研磨＆杵（金布尔Kontes ，目录号：885300 ）
质谱仪（Thermo Scientific，型号：Orbitrap Fusion ）
Nanodrop（Thermo Scientific，型号：ND3300 ）
pH指示条，Instachek （pH 0-13），Micro Essential Lab，型号：Hydrion ，目录号：JR-113 ）
压力注入室（Next Advance，型号：PC77）
SpeedVac +真空泵和平板转子（Savant，型号：SC210A）
管旋转器（Thermo Scientific ，目录号：88881001 ）
涡旋混合器（Thermo Scientific，目录号88880017 ）
Triversa Nanomate （Advion ，型号：TR263 ）

软件
EpiProfile Lite （Sidoli 等，2019）。可在GitHub上找到https://github.com/zfyuan/EpiProfileLite

程序
细胞培养与收获
一个包含约1000万个细胞的10 cm 2 平板可产生约100个细胞μ克组蛋白从人成肌细胞系，LHCN-M2以及从大多数细胞系。这是超过足以DI-MS分析，考虑到几μ GS 材料中的1 μ 克/ μ 升注射。然而，取决于细胞状态（例如，增殖与分化）和处理，可获得可变量的组蛋白。例如，我们发现，与成肌细胞相比，一盘肌管的组蛋白产量更高，因为肌管是携带大量染色质的多核细胞。组蛋白分离过程中DNA凝胶化可能导致较低的组蛋白产率，可以通过以下预防措施避免此情况：（i ）使用细胞解离缓冲液而不是胰蛋白酶-EDTA分离细胞（ii）使用新鲜沉淀代替在液体中速冻的沉淀氮。
在15 ml管中用10 ml不含Ca 2+ 和Mg 2+ （PBS）的磷酸盐缓冲盐水收集解离的培养细胞（> 5 x 10 6 cells / ml）。
通过以300 xg 旋转5分钟来沉淀细胞。丢弃上清液。
用10 ml PBS以300 xg 洗涤痕量解离缓冲液/培养基5分钟。丢弃上清液。
如果使用组织或活检，请用干净的剃刀将它们切成小于1毫米的切片，并收集在5 ml pf的PBS中。[R EPEAT 小号TEP A3。
估计填充的细胞沉淀体积，并在管底部用永久墨水标记。
在此阶段，将细胞快速冷冻在液氮中，并储存在-80°C直至提取组蛋白。
注意：建议在每个阶段对此协议进行特定于细胞类型的修改。例如，易碎的细胞（如成肌细胞）即使冻融也很容易裂解，我们建议使用新鲜的沉淀。

分离细胞核（所需时间：长达1小时）
当一个人同时处理3 44个样品时，样品制备的批次间差异很小。由于核分离过程中染色质中组蛋白的损失，大多数用户的收率较低。如下所述，通过仔细优化裂解步骤可以大大减少这种损失。

准备缓冲区，如下所示：
NIB洗涤缓冲液：每体积的细胞沉淀（100μl 细胞沉淀：5 ml NIB）取50体积的NIB 。加入5 微升的1M DTT，10 微克每2.5 μM 微囊和5M丁酸钠，以及12.5 微升的200mM AEBSF的。今后，NIB指NIB + 磷酸酶和HDAC抑制剂。该缓冲区用于清洗。
NIB裂解缓冲液：取约1/ 4 个NIB洗涤的缓冲液如上述制备进新管中，并添加NP-40的替代的0.1％（V / V）。该缓冲液用于裂解。
在冰上解冻冷冻细胞。
注意：根据细胞沉淀物大小对样品进行分组，然后转移到相同的行或列中，以便可以使用多通道移液器分配相似的体积。
在冰上轻柔地将细胞重悬于10体积的NIB洗涤缓冲液中。转移至96孔板。
注意：使用板200的阱容量微升为丸粒尺寸最多20 微升。对于较大的沉淀，例如60μl- 200μl ，分别使用600μl -2ml深孔板。
通过在4°C下以700 xg离心5分钟洗涤细胞。
将平板倾斜到一定角度，并使用多通道移液器小心地从侧面除去上清液（请勿使用真空抽吸器，因为此阶段沉淀物很松散，会丢失）。
使用永久性标记在易于目视检查的孔中标记填充的细胞体积，例如A列和H行。
从试剂储器中添加10体积的NIB裂解缓冲液，并通过上下吹打细胞以打破团块而轻轻混合。
在冰上孵育5分钟。
注意：将96孔冰块放在200μl的冰上，以确保均匀的温度传导。
在4°C下以700 xg 离心细胞5分钟。
检查颗粒大小。这应该小于初始填充细胞体积的一半（在管底部用标记显示）。如果不是，请轻柔地重悬所选孔的内容物，并遵循以下两个选项之一：
以5分钟为增量增加孵育时间或
增加NP-40的浓度，以0.05％的增量递增，然后离心
重复小号直到获得最佳粒料尺寸TEPS B8-B10。
注意：优化时间和去污剂浓度，以便在冰上孵育后获得细胞核而不会产生DNA胶凝。对于强壮的细胞和组织，使用Dounce匀浆器轻轻匀浆，并伴以锥虫蓝排除法以监测裂解情况。
注意：过度裂解将导致细胞核中组蛋白的损失。
离心后除去NIB裂解缓冲液一旦粒料尺寸减小，如在小号TEP B5。
NP-40的替代的洗涤痕迹我■至少8 VO 卢梅斯ö ˚F NIB相对于初始丸粒尺寸。
注意：每种试剂都应使用新鲜的/专用的（如果重复使用的话）聚丙烯试剂容器。
在700 xg / 5 min / 4°C下旋转，并在S tep B5中移出上清液。
重复小号TEPS B12-B13，两次或更多次，直到没有来自洗涤剂泡沫在缓冲器被看见。
移出上清液后，保存沉淀物（染色质和组蛋白）。请勿使用真空吸尘器。
如果不立即使用，请用密封垫盖住板，并在液氮中速冻，以包裹包装的保鲜膜（无限期）于-80°C。
酸提取他的口气
向细胞核中加入5倍体积（基于原始洗涤后的细胞沉淀物大小）的冷0.4 NH 2 SO 4，并通过轻轻研磨将其重悬。
将样品在4°C下轻轻摇动孵育2小时。
注意：将五体积的酸添加到一体积的初始细胞沉淀中。此比例适合最大200μl的颗粒大小。孵育2小时至关重要，因为在酸性条件下放置更长的时间会导致提取非组蛋白染色质蛋白。
使用多通道移液器在两次混合之间（开始孵育一个小时后）混合一次。
在3,400 xg / 5 min / 4°C下离心，然后将上清液轻轻转移至新的96孔板中，而不会干扰沉淀（颗粒含有非组蛋白，DNA，RNA 等）。此酸提取物现在包含组蛋白。
向上清液中加入100％冷的TCA，使最终浓度为30％。样品将出现浑浊，表明存在蛋白质，在这种情况下为组蛋白。移液几次即可快速轻柔地混合。
将垫子固定到板上，使蛋白质在冰上不受干扰地沉淀，从几个小时到一整夜。
在3,400 xg / 5分钟/ 4°C下离心。组蛋白可以看作是在墙上的发白涂层，在管的底部有沉淀物。
小心地取下垫子，并放一叠厚厚的薄纸，以完全覆盖所有有样品的孔。
通过快速摇动手腕来翻转板，使TCA上清液被吸到薄纸上。
重复小号TEP C9，以消除任何剩余的TCA。
用巴斯德玻璃移液管将等分的冷丙酮+ 0.1％HCl（预混合并在-20°C下储存）到新鲜的试剂容器中。
使用多通道吸管，将酸化的丙酮添加到墙壁上的发白涂层（组蛋白）的水平，以洗净杂质。
重复小号TEPS C7-C10。
加入冷的100％丙酮（储存在-20°C中）至组蛋白水平，并刮擦壁以将组蛋白收集到井底。
注意：丙酮会降解塑料。使用巴斯德玻璃移液器分配储液罐。每次使用新的水库。要转移到样品中，请使用塑料移液器吸头，但要尽快，并在每次分配时使用新鲜的移液器吸头。
在4°C下以最高速度旋转5分钟。
将薄板倒置在薄纸上，以除去上清液。
重复丙酮漂洗，使得没有的洗涤剂或酸遗体迹（小号TEP 小号C14-C16）。
风干沉淀物以在台式机上完全干燥，从30分钟到过夜。
用约30μlMS 级水重悬干燥的沉淀，用力吹打。组蛋白非常容易溶于水，不溶物主要是非组蛋白。
快速高速旋转以沉淀不溶性非组蛋白。
将纯净的上清液中的纯化的组蛋白小心地转移到新鲜的96孔板中。
使用<行或列的检查pH值1 μ 升样品拾起刚好接触与尖端，以避免丢失。
用100 mM碳酸氢铵调节至约pH 8.0。
使用读板器在595 nm下通过Bradford分析估算蛋白质浓度。
注意：BCA分析不适用于组蛋白估计，因为组蛋白半胱氨酸很少，色氨酸和酪氨酸几乎没有。
用speedvac 干燥板上的组蛋白。
将组蛋白重悬于MS级水中，使浓度为1μg / μl 。
将20μg 转移至新鲜的96孔板（容量为200μl ）中，以进行进一步处理。
用垫子密封并在-80°C下储存，直到进一步使用。另外，组蛋白可以在Speedvac 浓缩器中完全干燥，并无限期地存放在工作台上。
用Bradford分析法估算蛋白质
布拉德福德（Bradford）测定法在595 nm的酸性条件下测量蛋白质-库马西染料复合物的形成。实际上，蛋白质的精氨酸，赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸形成了该复合物。SDS和去污剂会强烈干扰该复合物的形成，从而影响蛋白质定量。为避免这种情况，请始终执行多次NIB洗涤，如果需要，还应进行丙酮洗涤。由于三氯乙酸的沉淀在一定程度上也消除了NP-40替代品，因此请勿跳过此步骤。
用MilliQ 水准备多达8种BSA标准品的稀释液，稀释范围为0.1-10 mg / ml 。
使Bradford试剂和样品达到室温。
在MilliQ 水中稀释储备试剂。
按照制造商的指示稀释BSA标准。
等分试样将Bradford稀释至96孔平底板（Fisher Scientific）。
向稀释的Bradford试剂中加入标准稀释液和样品。
混合而不会产生气泡。
按照制造商的说明进行测定。
按照分光光度计的操作说明进行操作，并读取595 nm处的吸光度。
根据BSA标准曲线估算蛋白质浓度。
组蛋白的化学衍生
在未修饰的/单甲基化的赖氨酸的ε-氨基上标记一个化学基团（如丙酰基）可在常规的“自下而上”组蛋白分析与质谱联用色谱中实现两个目的：a）尽管使用胰蛋白酶作为蛋白水解酶，但仍可模拟ArgC 消化； b）增加小组蛋白肽的疏水性，通过反相色谱改善其保留。在DI-MS中，不需要增加组蛋白肽的疏水性，因此在此协议中不使用胰蛋白酶消化后肽N-末端的衍生化。
为了协助样品制备的质量控制（QC），我们设计了一种与任何已知内源组蛋白肽没有同源性的合成肽进行质量控制。该具有序列GVKFRGSTGGKAPRGKAPATSGMVGPHR的肽以相同的频率模拟具有精氨酸和赖氨酸的组蛋白，并在丙酰化和胰蛋白酶消化过程中像组蛋白肽一样起作用。可以在DI-MS采集过程中检测和定量此肽的衍生和消化产物和副产物，以评估样品制备的质量，如表1所示（表1）：

表1.为质量控制而设计的序列的合成肽。可以通过胰蛋白酶对肽序列GVKFRGSTGGKAPRGKAPATSGMVGPHR进行丙酰化和消化，从而针对列出的样品处理中的各种问题生成具有特征m / z的不同长度的片段。名为“相对比率”的列是理想曲线的一个示例，其中前三个肽的总和表明“完全衍生化和消化”应超过0.95（或95％）；此运行通过过程QC。
检测到QC肽

在通风橱中，放置试剂（氢氧化铵，乙腈和丙酸酐），多通道移液器，P200和P10吸头盒（根据需要数量），专用/新试剂容器和pH纸卷（图2A）。

图2.组蛋白衍生化和脱盐。A.在化学罩中设置耗材，以快速进行衍生化。B.用装在移液器吸头晶片中的C18（白色塞子）和PGC（使用多通道移液器以乙腈浆液形式填充的黑色颗粒）制备脱盐级吸头。请注意，通常不使用第一行（行A），因为我们通常保留这些行以在MS分析过程中检查BSA标准和脱盐缓冲液。可以事先准备好这种尖端硅片，并在有盖的空尖端盒中将其存放在工作台上。C.将载物台尖端晶片放置在96孔板中的孔上。无德的四个角被束缚的提示，如果不使用所有的84口井。脱盐晶片被定位在微板的孔中，并被置于SpeedVac中用于洗脱板保持件。

约10使用μ 克重悬于MS级水，在一个板纯化的组蛋白。通过用100 mM氢氧化铵调节以确保pH 8.0。
QC的解冻一个小瓶肽存储为1 μ 克/ μ 升在-20℃等分试样。
注意：稀释后请完全使用。不要再FRE 结解冻。
使1:10稀释的1 μ 克/ μ 升QC肽在MS-级水，并添加0.1 μ 克（1 μ 升）至10 μ 克组蛋白/孔在板。拌匀
取MS级乙腈在专用试剂贮存和使用多道移液器，加入5 μ 升至样品孔并混合内容物。
移至化学通风橱，试剂，储液器，移液器，吸头盒，pH试纸条等均布置在板的两侧，以使分配时手的交叉最小（图2A）。
注意：从此步骤开始，所有步骤都必须在化学通风橱中进行，因为丙酸是刺激物，而氢氧化铵烟雾则有吸入危险。分配任何一种试剂时，请避免使用移液器和吸头，以免污染原料。而是将试剂倒出到容器中。直接输注MS对污染物（例如去污剂和聚合物）非常敏感，因为没有LC可以将其过滤掉。如果库存中积聚了这些污染物，这些污染物将被带到样品中，并抑制样品特异性肽信号。
执行衍生小号依照步骤E7- ë 10所证明（视频1）。

视频1 。单个用户快速衍生化

加入5 μ 升丙酸酐使用在一方面多通道移液管将第一行/列和通过移液混合。
注意：应迅速工作，以使丙酸酐在添加到样品中时保持新鲜和活性。在大气水分存在下，该试剂在组蛋白的未改性和单甲基化赖氨酸中将游离胺丙酰化后立即形成乙酸。
以中和酸性，迅速用12-17跟进μ 升使用多道移液器在另一方面氢氧化铵（可能需要取决于氢氧化铵的效力和样品类型进行调整）（视频1）。
注意：或者，两个人可以串联工作以快速完成这些步骤。
重复小号TEPS E5和E8的每一行/列。
检查几个随机行/列的pH值，以验证pH值约为8.0。如果没有，在一些添加氢氧化铵μ 升的增量，并通过移液拌匀。
注意：使用检查pH值< 1个μ 升样品拾起刚好接触尖端与样品，以避免样品损失。
在通风橱中孵育15分钟，以完成反应。
重复小号TEPS E4-E9，以确保丙酰胺在未修改的赖氨酸所有游离胺。
注意：将丙酸酐储存在氩气下（请参阅“ 缓冲液和试剂制备和储存：压缩气体”下的说明），以使其不会在大气中产生乙酸而失去活性。
使用适合板的speedvac 离心机干燥样品。这可能很容易花费> 1小时。
以1:20比例的胰蛋白酶添加到样品（0.5 μ 克胰蛋白酶至10 μ 克在20-30组蛋白）μ 升100mM的碳酸氢铵。
用氢氧化铵调节pH至8.0。
在长凳上孵育6小时至过夜。
储存在-80 °C或执行后续步骤。
使用C 18 / PGC末梢使丙酰化肽脱盐
在丙酰化的每个步骤中以及在组蛋白提取物中也都积累了盐。与肽相比，盐容易离子化并以加合物形式出现，与样品相比具有更高的信号强度，从而导致样品信号抑制。在进行MS分析之前，应将样品脱盐并通过C 18 / PGC 除去缓冲液。该基质还保留了疏水性肽，可在弱酸化的有机溶剂中洗脱，从而获得纯肽，用于MS分析。
在室温下工作台上准备阶段尖端所证明（视频2）。

视频2 。自制内部脱盐柱

使用剃须刀从P1000尖端的末端切出约0.5厘米，使孔的直径约为2毫米。
使用这个切好的尖端，打一个小圆盘C 18 。
使用一块熔融石英，用C 18 冲头塞住P200移液器吸头。
将这些堵塞的吸头排列在空的8 x 12格式的P200移液器吸头笔芯中。
使用镊子将塞子移到专用试剂容器中，从Hypersep 滤芯（Thermo Scientific）中移除多孔石墨碳（PGC）颗粒。
在100％乙腈中制成PGC浆液，然后将其加入塞住的P200吸头中，使乙腈排出后，约有0.5 cm的PGC材料在C 18 塞子上方沉降。这称为舞台提示（图2B）。
注意：浆液易于沉淀，因此在添加到C 18 吸头之前，移液器很难混合。乙腈预浸润C 18 / PGC并通过暴露极性基团激活它们，从而使肽与C 18 / PGC 结合。
在不抽真空的情况下，低速旋转级末端组件，以除去100％的乙腈。
注意小号：
在所有的自旋speedvac中以除去缓冲液（小号TEP 小号F8-F21）在应进行SpeedVac中没有真空。
可以预先准备阶段提示或脱盐柱并将其存储在空的提示框中。我们尚未测试过重复使用这些载物台提示，因为可能会残留样品。
从阶段尖与约70洗残余乙腈μ 升的0.1％三氟乙酸（TFA，洗涤溶液），同时注意其添加在末端的中间，使得其渗过PGC均匀。
以最低速度轻轻旋转30秒钟，以使洗涤液滴落。
重复小号TEPS F8-F9。
100添加μ 升0.1％TFA，以衍生肽。这会将样品酸化至约pH 4.0。
现在，将酸化的衍生化的肽样品轻轻地添加到位于中心的洗涤台头上。
低速旋转30 s。让液体流过。
洗在C结合的肽18 / PGC材料100 μ 升0.1％TFA的。
低速旋转30 s。
重复小号TEPS F15-F16。
将级头晶圆组件放在新的96孔板上进行洗脱。确保针尖正确对准孔。
注意用尖端将晶片和平板的四个角拴在一起（图2C）。
添加30 μ 升的60％乙腈/含0.1％甲酸轻轻放入阶段尖端的中心。
低速缓慢旋转30秒
使用带有真空的Speedvac 浓缩仪干燥洗脱的样品。
注意：任何时候都不要在speedvac 中打开热量，因为肽可能会聚集。
重悬于13 μ 升的水和在480nm处执行BCA肽测定以确保至少10的总肽浓度μ 克/样品。
在speedvac 中将板干燥。
用垫子盖住微孔板，将其保存在-80 °C的温度下。
之前使用质谱仪注入nanomate ，重悬样品中的60％乙腈/含0.1％甲酸的体积，让样品1的最终浓度μ 克/ μ 升最佳喷雾。

纳米电喷雾质谱分析

使用微流电喷雾电离（ESI）芯片和Chipsoft 软件，在NanoMate Triversa 仪器中分析样品。导电移液管尖端（发射极尺寸5 μ 米ID）主从96孔平板，用在一次性ESI芯片的背面喷嘴入口放满的样品尖对准样品，产生紧密的密封和独特的路径进入质谱仪。由于每个样品仅需使用移液器吸头和吸嘴一次，因此没有样品残留。使用Chipsoft 将机器人操作的这一部分编程到Nanomate Triversa 中。当重悬在甲酸中的样品通过带电的尖端喷出时，肽质子化，并进入热的（170 °C ）离子转移管，在其出口处的气相中蒸发，然后由质谱仪对其进行分析。我们描述了Orbitrap Fusion Tribrid （Thermo Scientific）的一种采集方法，但也可以使用其他质谱仪。我们建议使用带有选择性分析仪（如四极杆或离子阱）和高分辨率分析仪（如飞行时间或轨道阱）的混合质谱仪来获取信号。需要使用选择性分析仪来进行名为靶向选择离子监测（tSIM ）的扫描以进行肽信号的采集，以增强扫描的灵敏度，从而弥补液相色谱法的不足。在tSIM中，对MS1数据进行量化。需要高分辨率才能区分几乎同量异位的修饰，例如乙酰化（42.010 Da）与三甲基化（42.047 Da ）。应该执行MS / MS片段化以定量具有同量异位形式的肽。所有扫描应通过将离子发送到高分辨率质量分析仪中进行。
下面，我们将介绍使用仪器控制软件3.0 为Orbitrap Fusion Tribrid （Thermo Scientific）设计的方法。这些全局设置可以用作生成方法的起点。我们建议根据使用的仪器（参数优化补充牛逼能S1和补充牛逼能够S2）。补充表S3列出了m / z信号以靶向模式获得，用于定量（未）修饰的组蛋白肽。
尽管在不同时间（甚至由同一个人）执行样品制备而产生的一些批处理效应仍然存在，并且质谱仪的校准状态仍然存在，但使用该DI可以大大减少HPLC有助于MS辅助PTM分析的巨大差异-MS （Sidoli 等，2019）。我们建议以高通量方式准备和分析与研究有关的所有样品。我们还建议确保样品相对不含可电离的污染物，因为这些“背景”干扰会导致质谱分析中样品特异性信号的抑制。此外，注入污染物会减少S透镜在射频引导下的离子传输，从而导致数据采集质量差和仪器维护成本昂贵。

对于我们使用的参数，检查Xcalibur 原始文件大小是否约为2MB（兆字节）。该文件大小表示频谱相对密集，具有两组MS1和一个MS2。

在Thermo Xcalibur Qual Browser中，在RAW文件的“色谱图视图”中可视化总离子色谱图和基峰（图3）。

图3.通过在Xcalibur Qual Browser 3.1中检查质谱图来检查DI-MS的运行质量。良好的质谱分析显示所有离子的总强度，包括背景噪声以及扫描质量范围内的样品成分（左上），上方质谱图的基峰（左下方）和代表性的MS2谱图（右）。在orang e中，＃1表示运行良好的质量控制，其中MS和MS2均在不到2分钟的时间内被采集到。尽管该方法持续2分钟，但一旦记录了两次MS-MS2事件，纳米级物质就会停止采集并将剩余的样品返回到孔中。为了得到此质量好的光谱，最小10的μ 升以1mg / ml的浓度的肽是必要的。＃2表示没有聚合物加合物的高密度电离样品，＃3表示+2带电的丰富离子。

在右侧的“光谱视图”中扫描碎片离子的丰度和+2离子的存在。
组蛋白PTM的数据分析
我们在此方案中描述的高通量定量组蛋白PTM分析将使研究人员能够在自己的实验室中舒适地检查生物过程和疾病所缺少的流行病方面。在总共45个基因座中，从29个带有PTM的肽中进行了约220次相对定量，如甲基化，乙酰化和磷酸化。大致地，38个肽具有单甲基化，23个肽具有二甲基化，21个具有三甲基化，91个具有乙酰化和28个磷酸化。这些标记以所有组合形式出现，或者在同一肽的不同基因座上单独出现或作为多个标记出现。如图29种这些肽属于组蛋白16类型URE 1。因此，可用于在300个样品中产生的PTM信息富矿/周使得用于疾病后生生物标记物的发现它特别适合。光谱可以直接上传到EpiProfile Lite中，也可以通过从获取光谱的光谱中提取给定肽的信号强度进行手动分析。EpiProfile 精简版提取的信号肽呈现我Ñ 补充Ť 能够S2，包括同量异位的形式差分量化。

EpiProfile 精简版提供的结果表（称为“组蛋白比率”）具有大约150- 取决于物种200肽同种型。由于手动检查清单不胜枚举，因此使用适当的统计数据处理数据以检测最重要和最可靠的更改非常有帮助。当使用有限数量的重复实验（< 5个）时，我们建议使用t 检验来估计条件之间的显着差异。非参数统计通常会受到更多的重视，因为它也可以应用于没有高斯分布的复制品。但是，它不足以处理如此少量的数据点。如果观察到总体上乙酰化增加/减少的趋势，我们建议在将结果与“我们观察到催化组蛋白乙酰化的酶的整体活性更高”这样的结论之前，将观察结果与乙酰辅酶A的水平关联起来。
打开“组蛋白比率”表，其中包含已鉴定和定量的组蛋白肽的原始强度。
通过共享相同序列的所有肽的总强度对每个修饰的组蛋白肽进行归一化（图4）。例如，在人（和大多数其他真核生物）的H3 9_17肽中，含有H3K9me2的肽具有序列KSTGGKAPR。修饰为H3K9me2的肽的相对丰度计算如下：K9me2STGGKAPR强度/（KSTGGKAPR + K9me1STGGKAPR + K9me2STGGKAPR + K9me3STGGKAPR + K9acSTGGKAPR + KSTGGK14acAPR + K9me1ST9ac14PR9K14me 所有这些PTM形式的相对丰度之和为1。
注意：我们强烈建议使用EpiProfile Lite 对组蛋白肽进行提取离子色谱，因为已经进行了该计算，并且该软件会自动处理同量异位肽。

图4.相对比率和单个PTM丰度之间的差异，分别针对H3 9-17肽和H3K9me2进行了说明。H3K9me2的单个PTM丰度计算为：（H3K9me2 + H3K9me2K14ac）相对比率的总和。

比较两个条件时执行t 检验，或者比较两个以上条件时执行方差分析。由于相对比率的范围在几个对数中，因此倍数变化和P 值都使用对数值。
为严格起见，我们建议同时基于倍数变化和P 值显着性，将数据显示为火山图，在x轴上使用两个条件（例如处理后与未处理）和y之间的对数2 倍变化。轴，即t检验P 值的-log 2 。常规上，将显着性阈值设置为P 值< 0.05，当其转换为-log 2 时，P 值> 4.32。对于倍数变化的重要性，可以设置任何阈值，例如1的log 2 是两倍变化（图5A）。

图5.组蛋白PTM分析数据的可视化。A.火山图通过绘制两个条件之间的对数倍数变化[x轴，log 2 （处理/控制）]作为其重要性的函数[y轴，-log 2 （0.05）] ，提供了组信息。细长的椭圆形代表估算的Zscore 值，仅在治疗（红色）或对照（绿色）条件下表达。阈值的显着性是4.32 [= 日志2 （0.05）]并且对于倍数变化是1（= 日志2 的2）。红色方块代表在治疗中上调的组蛋白，绿色方块代表在对照中上调的组蛋白PTM。B. EpiProfile Lite 中“组蛋白比率_单个PTM”表的分析后表示。使用Zscore 归一化值在Perseus 1.5.3.2 版本中构建热图；该热图提供了样本表达水平，以及通过层次聚类显示的共趋势标记，列中有样本，行中有组蛋白标记。Hierarchial 集群是基于组蛋白标记的样品离开非集群。这里的样本显示的表达式范围是-2（下调，绿色）到3（上调，红色）。在两个共趋势标记块中，可以看到对照样品和处理后样品之间有明确的调节模式（从红色到绿色，反之亦然）。C. 总体乙酰化（ac）和甲基化（化合价me1，me2和me3以及总计me）的丰度可以用图形表示。超过条件单杠表示由显著变化吨- 试验：* P = 0.04，** P = 0.01和*** P = 0.0004。

将“组蛋白比率”表复制到一张新纸上。将所有乙酰化肽段的相对丰度相加，然后将它们与乙酰基辅酶A的相对变化进行比较。如果相关性是线性和正相关的，则该数据可能的生物学解释是乙酰基-CoA水平发生变化，从而影响组蛋白乙酰化的丰度。先前已说明了这种分析的一个示例（Simithy等人，2017）。
一旦确定了PTM ，这些PTM在所分析的条件之间受到显着调节，则可能的下一步是确定哪个组蛋白作者可能对此调节负责。然后，该酶是使用抑制剂或其他转录后调控（例如，敲除）进行互补治疗的潜在靶标。
将组蛋白标记与作者联系起来，以了解在数据集中观察到的变化的生物学相关性。补充表S 4 总结了一些已知的表观遗传因素，可以在机理研究中对其进行研究。
归一化强度也称为相对比率，因为它们表示肽内每种修饰形式的比率。这也称为组合标记的相对比率表，以将其与单个PTM区别开来，该表概述了肽中PTM的出现，而不管是单个标记还是与另一个标记组合使用。例如，H3K9acK14ac的单个PTM丰度计算为：（H3K9ac + H3K14ac + H3K9acK14ac + H3K9me1K14ac + H3K9me2K14ac + H3K9me3K14ac）强度的总和。H3K9me2的单个PTM丰度的另一个示例如图4所示。
在EpiProfile Lite中，将计算H3和H4的单个PTM比率，并将其用作“单个PTM”表。可以将其标准化为使用Perseus制作的z得分和热图（图5B）（Bhanu 等人，2019）。
全球乙酰化和不同的条件甲基化也可以进行比较（图5C）。
请参阅补充牛逼能小号 4 组蛋白翻译后修饰表观遗传机制的相关性。
跟进使用作家和橡皮擦，功能性研究，基因组范围的富集的研究测定的MS辅助PTM分析的ChIP 使用-Seq或基因特异性富集的ChIP -qPCR （巴努• 等人，2019）。
我们所描述的96孔格式的DI-MS方法可以使用Triversa Nanomate ESI芯片轻松适应384或1356孔格式，以实现生命科学应用中更高的通量。除了此处描述的组蛋白PTM分析外，还可以通过优化针对样品的理化性质的方案对任何分析物进行DI-MS。尽管与LC-MS相比该方法是可靠的，但仍有提高灵敏度的余地。为了获得高信噪比，需要改进清洁的分析物提取和脱盐程序。诸如间硝基苄醇（m-NBA），二甲基亚砜（DMSO）和四亚甲基砜（环丁砜）之类的增压剂可增强信号丰度，值得研究。我们直接注射遇到的问题之一是即使使用ESI芯片，喷雾稳定性也很高。通常，电喷雾电离易受干扰引起的电荷竞争，而其他模式（例如大气压化学电离（APCI））则不然。组蛋白可能具有良好的热稳定性，并且带正电，因此对APCI有利。借助Advion进行的硬件更改，还可以探索APCI直接输注以提高MS敏感性。

菜谱
核隔离缓冲液（NIB-250）
15毫米Tris-HCl（pH 7.5）
15毫米氯化钠
60毫米氯化钾
5毫米MgCl 2
1毫米CaCl 2
250毫米蔗糖
储存并储存在-20 °C 中
NP-40替代
ddH 2 O中的10％（v / v）
室温保存
蛋白酶抑制剂（使用前应先加入缓冲液中）
ddH 2 O中的1 M二硫苏糖醇（DTT）（1,000 x ）
在ddH 2 O中为200 mM AEBSF （400 x ）
等份储存在-20 °C的股票
磷酸酶抑制剂（使用前应先加入缓冲液中）
2.5 μM 微囊在100％乙醇（500 X ）
等份储存在-20 °C的股票
HDAC抑制剂（在使用前将其新鲜添加到缓冲液中）
5 M丁酸钠，用NaOH调节至pH 7.0（500 x ）
等份储存在-20 °C的股票
0.2 M（0.4 N）硫酸（H 2 SO 4 ）（v / v）
在通风橱中，将5.54 ml浓H 2 SO 4 加入1 L ddH 2 O中。
储存在4 °C
ddH 2 O中的100％三氯乙酸（TCA）（w / v）
将227 ml的ddH 2 O加入500 g的TCA中。该澄清溶液约为1.45 g / ml
储存在4°C
丙酮+ 0.1％盐酸（HCl）
丙酮中含0.1％（v / v）HCl
储存在-20°C的琥珀色瓶中
100 mM碳酸氢铵（NH 4 HCO 3 ）（w / v）pH 8.0
将79 mg NH 4 HCO 3 盐溶于8 ml ddH 2 O
用甲酸将pH调节至8.0
调至10毫升
将缓冲液放小，然后盖紧冰箱盖
当pH随时间变化时，请先检查pH

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助：NIH AI118891，CA196539，St。Jude Collaborative A11576和GM110104。我们也感谢Sidoli 等人的原始研究论文。（2019），从该协议派生。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献
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