材料和试剂
类器官文化
24孔组织培养板（Corning，Falcon，目录号353226）
50 ml和15 ml锥形离心管（Corning，Falcon，目录号s ：352096、352070）
15毫升STEMFULL TM低细胞粘附管（住友电木Ç Ò 。，目录号：MS-90150Z）
1.5 ml Eppendorf管（Eppendorf Safe-Lock Tubes，货号：0030121023）
70 μ米细胞过滤器（康宁公司，Falcon，目录号：352350）
通过内窥镜检查获得的患者肠内活检样本
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537-500ML）（储存在4°C）
基质胶（康宁，目录号：356231 ）（š在4℃tored）
细胞回收解决方案（Corning，Thermo Fisher Scientific ，目录号：354253）（存储在4°C下）
Advanced-DMEM （Thermo Fisher Scientific，目录号：12491015）（存储在4°C下）
青霉素/链霉素（Nacalai Tesque ，目录号：26253-84）（储存于4°C）
1 mol / l-HEPES缓冲溶液（Nacalai Tesque ，目录号：17557-94）（储存在4°C）
GlutaMAX TM -I（100 x ）（Gibco，Thermo Fisher Scientific ，目录号：35050-061）（存储在4°C下）
0.5 M EDTA（（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
台盼蓝溶液（Thermo Fisher Scientific ，目录号：15250061）
N-乙酰半胱氨酸（Sigma，目录号：A9165-5G ）（储存在-20°C，1 M，10 ml等分试样）
胃泌素I （Sigma，目录号：3006）（储存在-20℃下，100微升，1 ，000微升等分试样）
N2补充剂（R＆D Systems ，目录号：AR009）（储存在-20°C，100x，1小瓶）
B27补充品（R＆D Systems，货号：AR008）（储存在-20°C，50x，1小瓶中）
重组小鼠EGF（R＆D Systems，目录号：2028-EG-200 ）
（储存在-20℃下，20微克/ ml时，等分试样1 ，000微升）

重组小鼠成头蛋白（R＆d系统，目录号：1967-NG-025 / CF ）（储存在-20℃下，20微克/ ml时，等分试样250微升）
重组人R-脊椎蛋白-1（R＆d系统，目录号：4645-RS ）（保存在-20℃，100微克/ ml时，等分试样500微升）
重组小鼠的Wnt-3A（R＆d系统，目录号：1324-WN-010 / CF ）（存储在- 20℃，10微克/ ml时，等分试样1 ，000微升）
烟酰胺（R＆d系统，目录号：4106 ）（保存在-20℃，1米升，等分试样1 ，000微升）
注意：以粉末形式存放在RT货架中。Nic 6.1 g + ddH 2 O 50 ml，等分试样各10 ml放入15 ml F alcon管中。解冻一支试管时，等分1.5毫升的戊烷并保存。

A83-01（Sigma-Aldrich，目录号：2939 ）（存储在-20°C，10 mM，100μl等分试样中）
注意：避光。等分试样10毫稀释成Eppen dolf管中，用20倍对其进行标记，进一步稀释10毫Eppendolf管与DMSO和等分试样100微升每。

SB202190（Sigma-Aldrich公司，目录号：1264）（储存在4℃，150 μ升等分试样）
注意：SB 202190 10毫克+ DMSO 3 ，018微升。等分试样150微升每并冷冻于-20，直到使用。

Y-27632（R＆d系统，目录号：1254 ）（p从光rotect，储存在-20℃，10毫米，150微升等分试样）
人肠基础培养基（请参阅食谱）
人小肠类器官生长介质（请参阅食谱）

单细胞分析
C1前置放大器IFC（10-17微米，Fluidigm公司，目录号：100-5480）
48 x 48 IFC芯片（Fluidigm ，目录号：BMK-M-48.48）
TrypLE Select（瑟莫·费舍尔科学公司（Thermo Fisher Scientific），目录号：12563011）（存储在4°C下）
用于前置放大器的C1单细胞试剂盒（包括模块1，模块2：Fluidigm ，目录号; 100-5319）（存储在-20°C下）
单细胞至CT试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，目录号：4458236）（存储在-20°C）
LIVE / DEAD生存力/细胞毒性试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，目录号：L3224）（储存在-20°C）
汇总的底漆（请参阅食谱）
裂解最终混合物（请参阅食谱）
RT最终混合物（请参阅食谱）
PreAmp最终混音（请参阅食谱）
活/死细胞染色（请参见食谱）

碧欧马克高清
2x上样试剂1.5 ml（Fluidigm ，目录号：100-7611）
20x TaqMan基因表达测定（Thermo Fisher Scientific，目录号：4351372）
2x预混液（Thermo Fisher Scientific，目录号4369514）
20x GE样品加载试剂（Fluidigm ，目录号：100-7610）

设备

移液管（5毫升，10毫升，25毫升，50ml）中，微移液器（10微升，20微升，200微升，1000微升）
多通道移液器（Mettler Toledo ，RAININ，型号：E 8-20 XLS +，目录号：17013798）
离心机
涡旋混合器
血细胞计数器（Burker -Turk，Fujirika Co.，A114）
37 °C ，5％CO 2细胞培养培养箱
荧光显微镜（Keyence，型号：BZ-X700，）
C1单细胞自动制备系统（Fluidigm ，美国加利福尼亚州旧金山）
C1单细胞自动制备阵列IFC（MX）（Fluidigm ，美国加利福尼亚州旧金山）
Biomark HD系统（Fluidigm ，美国加利福尼亚州旧金山）

软件

奇异分析工具集软件v3.5.2（Fluidigm，美国加利福尼亚州旧金山）
R软件
该帕特克的基因组套件（6.6-6.16.0812版本，帕特克，切斯特菲尔德，密苏里州，美国）

程序

第一部分：隐窝分离和上皮类器官培养

从患者活检样本中分离和培养小肠类器官的步骤
小肠肠镜活检样本取自进行小肠肿瘤，隐匿性出血或克罗恩病等疾病评估的患者。从每个患者的最多8个活检样本取自回盲瓣近端约100 cm的区域。应当从每个患者那里获得伦理委员会的批准和书面知情同意。
使用50 ml Falcon管，用冷PBS洗涤片段，直到澄清上清液为止。
将样品在15 mM EDTA / PBS溶液（旋转）中于4°C孵育30分钟（10 ml PBS + 300 µl 0.5 M EDTA）。
除去EDTA缓冲液后，添加10 ml PBS和涡旋2分钟以分离肠隐窝（图1）。

图1.新鲜嵌入患者的小肠隐窝。标度b ar s = 1 mm（左）和100μm （右）。

通过在显微镜下观察确认完整的隐窝隔离（参见注s ）。
在管沉淀下来的试样后，收集上清液并转移至50ml ˚F爱尔康管通过70过滤μ微米的过滤器。
重复第I部分的步骤A5约2-3次，直到收集到大约30 ml体积的含有溶液的隐窝。
将试管以300 xg离心3分钟以沉淀。
用10 ml Advanced-DMEM / F12重悬细胞沉淀，并转移到一个STEMFULL TM管中。
离心管中，在300 ×g下FO ，R 3分钟以沉淀。
在显微镜下检查沉淀后，小心吸出上清液，并加入所需量的Matrigel（每孔30-50 µl）以嵌入隐窝（每孔20-30隐窝）。
后轻轻移液管吨我纳克基质胶内，轻轻放在24孔板应用30μl的基质胶。孵育30-60分钟以使Matrigel聚合。
向每个孔中添加500 µl人肠生长培养基。在最初的3天中，向培养基中添加10 µM的Y-27632。

维持和通过小肠类器官的程序
隔离后，每两天更换一次小肠生长培养基。
隔离13天后，您将能够看到类器官的生长，它们开始形成称为“萌芽”的隐窝状结构（图2）。为了继代培养，除去生长培养基，并向孔中加入800 µl冷细胞回收溶液。使用细胞回收液，通过1,000 µl移液管刮掉含有类器官的Matrigel。

图2.从患者身上建立小肠类器官。标度b ar s = 1 mm（左）和100μm （右）。

将再悬浮液转移到15 ml STEMFULL TM试管中。使用P100移液器，剧烈吸移50-100次，以将类器官机械分解为较小的碎片。在显微镜下检查碎片后，向混合物中加入9 ml冷的Advanced-DMEM / F12。
将细胞以300 x g离心3分钟。
小心吸出上清液，然后将沉淀重新悬浮在Matrigel中。通常，以1：5-6的比例分割。在大约第13天，已建立的类器官开始萌芽。

第二部分：单细胞水平的基因表达分析

培养的类器官细胞的单细胞解离
从每个孔中移出全部体积的生长培养基（使用2-3个孔以获得足够数量的细胞）。
使用与通过培养的类器官中所述相同的方法，将类器官收集在15 ml STEMFULL TM管中，用力吸打50-100次，以机械方式将类器官分解为较小的片段。向混合物中加入9毫升冷Advanced-DMEM / F12。
以300 xg离心3分钟，然后吸出上清液。
将5 ml的TrypLE select加入沉淀并以600 rpm涡旋10分钟（加入Hoechst 10μl ）。
10分钟后，剧烈摇动试管10次，以将其进一步分离成单个细胞。
以500 xg离心3分钟，然后确认调色板。
用千重悬微升的高级-DMEM / F12 ，并将它们传送到1.5ml Eppendorf管中，并通过使用常规的台盼蓝染色计数活细胞数目（优化的细胞浓度：3×10 5个细胞/ ml ，预期细胞存活率> 70％）。
取出所需量的含溶液细胞，以500 xg离心3分钟，然后吸出上清液。
与1000重悬微升PBS中，并继续进行到C1协议。

将单个单元格加载到芯片中（C1前置放大过程）
PR epare单细胞悬浮液C1装载通过混合预先制备的细胞悬浮液（A9）的d C1细胞悬浮试剂而解冻其他试剂。
组分体积（微升）

细胞166-250K / ml的30微升

C1细胞悬浮试剂（Fluidigm公司）20微升

共有50微升

C1芯片灌注
打开C1机器，放置一个新的C1单电池自动制备IFC并按如下所示使用每种试剂（图3 ）。

图3 。一个板启动的应用程序（Fluidigm公司C1到的Taqman引物协议，PN100-6117）

加载每种试剂后，将其放置在平台上并选择Prime程序并运行（需要10分钟）。
重要提示：灌注后，应在1小时内涂抹样品，以防止灌注剂变干。

在对板进行底涂时，准备Lysis Final Mix，逆转录（RT）Final Mix和PreAmp Final Mix，并将m放在冰上（食谱4-6）。
细胞应用和染色
灌注后，如下所示除去封闭溶液（图4 ）。
移取准备的细胞混合物10次，然后将20μl涂在蓝色编码的孔中。
准备C1 LIVE / DEAD（参见ř ecipe小号）和申请20微升到粉红色编码井。

图4 。细胞的应用和染色给C1板（Fluidigm公司C1到的Taqman引物协议，PN100-6117）

将板放在舞台上，选择“ Cell Load＆Stain”程序并运行（此过程需要60-80分钟）
程序结束后，取出板并确认单细胞captur È （图5 ）和96个孔的细胞生存力显微镜（BX-X700，基恩士，大阪，日本）下。

图5 。用钙黄绿素AM阳性染色的活细胞捕获实例和用Ethidium homodimer-1染色的死细胞实例。规模b AR = 100 μ米。

确认细胞后，应用每种溶液中所示的贝洛W（图6 ）（RECIP上课4-6）

图6 。的预放大的解决方案到应用C1板（Fluidigm公司C1到的Taqman引物协议，PN100-6117）

将盘子放在舞台上，然后选择PreAmp程序并设置估计的结束时间（这是一整夜的过程）。
重要的是在完成后的一个小时内收集样品；否则，样品将蒸发。
准备一个新的96孔板中和等分试样25微升C1 DNA稀释试剂的进入每个标记的稀释收获板以及
哈尔韦斯吨预扩增产物表明在下面并与每个拌匀与使用8通道移液器DNA稀释液（每孔具有约3.6微升）（图7 ）。
将收获的板保存在-20°C下。
组分体积（微升）

C1 DNA稀释试剂（Fluidigm ）25

C1收获扩增子3

总计28

图7 。吸移的预扩增产物的步骤从一个C1-板至96孔板（Fluidigm公司C1到的Taqman引物协议，PN100-6117）

Biomark HD工作流程
多重定量PCR分析的进一步扩增和数据获取将使用Biomark 48.48进行。动态阵列IFC和Biomark HD系统（Fluidigm ，美国加利福尼亚州旧金山）。动态阵列IFC系统运行纳米流体IFC电路，该电路可自动将收获的样品与一组基因测定结合起来。

准备中
如下所示准备“ 10 x分析混合液”和“样品混合液”。

TaqMan底漆10 x分析混合物

组件

每体积入口（μ升）

每胰岛体积超龄（μ升）

为48.48体积（μ升）

为96.96体积（μ升）

2 x上样试剂

2.5

6.0

X 60 = 360

X 120 = 600

20 x TaqMan基因表达分析

2.5

6.0

总容积

5.0

6.0

300.0

600.0

最终浓度为10倍

引物：9μM探针：2.5μM

储存在-20 °C

样品混合

组件

每体积入口（μ升）

每胰岛体积超龄（μ升）

为48.48体积（μ升）

为96.96体积（μ升）

2 x材料混合

2.5

3.0

X 60 = 180.0

X 120 = 36.0

20 x GE样品加载试剂

0.25

0.3

X 60 = 18.0

X 120 = 36.0

基因

2.25

2.7

总

5.0

6.0

198

396.0

启动IFC和样品加载
确保对48.48动态阵列IFC使用IFC控制器MX，对于96.96动态阵列IFC使用IFC控制器HX。

一种。将控制管路流体注入IFC上的每个蓄能器。

b。取下并丢弃IFC底部的保护膜。

C。将IFC放入适当的控制器中，然后运行适当的“灌注”脚本以将控制管路流体灌注至IFC中。每种IFC类型都对应一个不同的脚本编号，并且印版ID号将由控制器标识（灌注最多需要30分钟）。

重要提示：请确保在完成底漆后1小时内运行“加载”，因为板将变干。

d。从控制器上取下IFC，然后将样品和测定溶液吸移至IFC的入口中（每个5μl ）。

e。将IFC返还给控制器。

F。运行适当的“ Load Mix”脚本。气压迫使样品和基因测定溶液进入IFC，在此混合。

G。从控制器中卸下已装载的IFC。

H。将IFC放入Biomark HD仪器中，确保IFC上的A1角与仪器托盘上的A1对齐。

重要提示：确保完成“ Load Mix”脚本后1小时内运行Biomark HD，因为板将变干。

运行Biomark HD
打开Biomark HD和计算机。
单击名为“ Biomark Data Collection”的图标。
CCD摄像机的温度达到-5 °C时，请等待应用程序显示“就绪” 。
单击默认桌面的“开始新运行” 。确认Ť他“数据收集”屏幕出现响应。
将预装的IFC放在托盘上，然后单击“加载”。托盘缩回，系统扫描条形码并识别IFC。
点击下一步”。浏览并选择您想要保存的文件。
选择基因表达应用程序。选择被动参考（ROX）。选择探针，然后选择“下一步” 。
选择浏览和协议文件。开始运行。

数据分析

使用Singular Analysis Toolset Software v3.5.2（Fluidigm ，旧金山，加利福尼亚州，美国）和Partek Genomic Suite（版本6.6-6.16.0812，Partek ，Partek ，Chesterfield，MO ）处理从多重单细胞基因表达分析获得的数据。遵循标准工作流程。

笔记

可以从内窥镜活检样本中收获的地穴数量非常有限。在步骤A4之后，取出1ml隐窝悬浮液并将其铺在24孔板上，在显微镜下观察并确认存在隐窝。

菜谱

1.人肠道基础培养基

组件

股票骗局。

最后的骗局。

/ 500毫升培养基

先进的DMEM / F12

1倍

500毫升

GlutaMAX-1

200毫米

2毫米

5毫升

HEPES

1 M

10毫米

5毫升

青霉素/链霉素

10 ，000 U / ml的

100单位/毫升

5毫升

N-乙酰半胱氨酸

500毫米

1毫米

1毫升

胃泌素

100微米

10毫米

50微升

N2补充

100倍

1倍

5毫升

B27补充

50倍

1倍

10毫升

2.人类小肠类器官生长介质

组件

股票缺点

最终缺点

单元

1口

2口

毫升

0.5

1个

基础培养基

--

--

毫升

0.25

0.5

生长因子

20微克/毫升

50 ng /毫升

微升

1.25

2.5

米·诺金

20微克/毫升

100 ng /毫升

微升

2.5

5

m R-spondin-1

100微克/毫升

1微克/毫升

微升

5

10

m Wnt-3A

10微克/毫升

300 ng / ml

微升

15

30

烟酰胺

1 M

10毫米

微升

5

10

A83-01

500微米

500 nM

微升

0.5

1个

SB202190

10毫米

10微米

微升

0.5

1个

3.合并引物

组件

体积（微升）

1微升的每个引物对（100 μM每个）

1.0（x 93 = 93微升）

可选的RNA Spike引物

1.0（x 3 = 3微升）

C1 DNA稀释试剂

104.0

总

200.0

最多可保存6个月（-20°C）

4.裂解最终混合物

组件

体积（微升）

C1 DNA稀释试剂（Fluidigm ）

0.90

单细胞裂解液（Thermo Fisher Scientific ）

12.75

C1 Lysis Plus试剂（Fluidigm ）

4.35

总

18.0

5. RT最终混合物

组件

体积（微升）

单细胞VOLO RT混合液（Thermo Fisher Scientific ）

5.84

单细胞SuperScript RT（Thermo Fisher Scientific ）

3.62

停止解决方案（赛默飞世尔科技）

1.94

C1加载试剂（Fluidigm ）

0.60

总

12.00

6. PreAmp最终混音

组件

体积（微升）

单节PreAmp混音（Thermo Fisher Scientific ）

12.0

C1加载试剂（Fluidigm ）

3.0

无DNA水（DPEC）

30.0

混合引物（500 nM ）

15.0

总

60.0

7.活/死细胞染色

组件

体积（微升）

C1细胞洗涤缓冲液（Fluidigm ）

1250.0

Ethidium homodimer-1（LIVE / DEAD试剂盒，赛默飞世尔科技）

2.5

钙黄绿素AM（LIVE / DEAD试剂盒，赛默飞世尔科技）

0.625

总

1253.125

致谢

该协议改编自Sato等人。（2009年）一第二铃木等人。（2018）（Fluidigm ，C1 microRNA PreAmp协议）。这项工作得到了MEXT / JSPS KAKENHI（18K15774、18K15743、19H03634、19K17484）的支持；来自AMED的研究中心网络计划以实现再生医学（18bm03041h0006、18bk0104008h0001、19bm0304001h0007、19bk0104008h0002、19bm0404055h000）。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

东京医科牙科大学和横滨市立医院伦理委员会批准了我们的研究（M2000-2093和M2000-1176）；并从每位患者获得书面知情同意书。

参考文献

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