材料和试剂

A、消耗品
1. 无菌吸管头（Axygen，目录号：TF-300-R-S[10µl]、T-350-C-l-R-S[300µl]、TF-1000-R-S[1000µl]）
2. PCR微管（BioExpress，目录号：T-3135-2）
3. 60 mm x 15 mm圆形培养皿（VWR，目录号：100488-404）

B、活性细胞
1. 大肠杆菌HST08适能电池（国产，方案1)，储存于-80°C
2. 根癌农杆菌GV3101适能电池（国产，方案2)，储存于-80°C

C、向量
1. pHEE2E TRI（Addgene，目录号：71288），储存温度-20°C
2. pKIR1.1（Addgene，目录号：85758），储存于-20°C
注：两种载体的序列可以在Addgene在线上找到。
pHEE2E三序列：https://www.addgene.org/71288/sequences/
pKIR1.1序列：https://www.addgene.org/85758/sequences/

D、寡核苷酸10µM
双-sgRNA1_F:5′-cacctgcatacatgn20（原间隔区1）gtttagagctaaatagc-3′
双-sgRNA2_R:5′-cacctgcatacaaac20（原间隔子2反向补体）caatctagtcga-3′
Mlo 1938:5′-TCCCAGGATTAGAATGATTAGG-3′
底漆_F:5′-ttctctctgctctctcgtag-3′
底漆：5′-GGCCCAATATCTCTTTTCCAAAGAC-3’
Cas9ˉF:5′-cagcgacaagagatagc-3′
Cas9ˉR:5'-ATGGTGGGTACTTCGTG-3''

E、酶和缓冲液
1. AarI（赛默飞世尔科技公司，产品目录号：ER1581），储存于-20°C
2. T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202L），储存于-20°C
3. T4多核苷酸激酶（NEB，目录号：M0201L），储存于-20°C
4. T4 DNA连接酶反应缓冲液（10x）（NEB，目录号：B0202S），储存于-20°C
5. 碱性磷酸酶，小牛肠道（CIP）（NEB，目录号：M0290），储存于-20°C
6. Phusion高保真DNA聚合酶试剂盒（新英格兰生物实验室，目录号：M0530S），储存温度-20°C
7. HotMaster Taq DNA聚合酶（VWR，目录号：QUNT2200330），储存于-20°C
8. Wizard®SV凝胶和PCR清洁系统（Promega，目录号：A9282），室温下储存
9. DNA质粒试剂盒（VWR，目录号：D6943-02），室温保存

F、试剂
1. MES（Sigma-Aldrich，目录号：4432-31-9），室温储存
2. KOH（Sigma-Aldrich，目录号：1310-58-3），室温下储存
3. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：57-50-1），室温储存
4. 植物琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：9002-18-0），室温保存
5. Bacto琼脂（BD Biosciences，目录号：214030），室温保存
6. Bacto胰蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211699），室温储存
7. Bacto酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212730），室温储存
8. 氯化钠（Fisher Scientific，目录号：7647-14-5），室温下储存
9. Murashige&Skoog培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M524），4°C下储存

G、抗生素
1. 大观霉素（VWR，目录号：101454-196），储存于-20°C
2. 利福平（VWR，目录号：13292-46-1），储存于干燥通风处
3. 庆大霉素（VWR，目录号：97062-974），保存于4°C
4. 卡那霉素（VWR，目录号：25389-94-09），4°C保存

H、介质（见配方）
1. LB液体培养基+100 mg/L大观霉素（4°C保存一个月）
2. LB琼脂平板+100 mg/L大观霉素（4°C保存一个月）
3. LB液体培养基+100mg/L大观霉素+20mg/L利福平+25mg/L庆大霉素+25mg/L卡那霉素（4°C保存一个月）
4. LB琼脂平板+100 mg/L大观霉素+20 mg/L利福平+25 mg/L庆大霉素+25 mg/L
5. ½MS中板
注：在添加抗生素之前，所有培养基都需要高压灭菌。对于培养皿，每个培养皿应使用20ml培养基。

设备

1. 移液管（Thermo Scientific，FinnPippetTM F2，目录号：4642010[0.2-2µl]、4642030[1-10µl]、4642060[2-20µl]、4642080[20-200µl]、4642090[100-1000µl]）
2. 培养箱（Thermo Scientific，目录号：51028132）
3. 振动筛（Eppendorf，型号：New BrunswickTM Innova®44，目录号：M1282-0000）
4. 立体荧光显微镜（徕卡，型号：M205FA）
5. Gel Doc EQ系统（Bio-Rad，Universal Hood II，型号：BGDII）
6. 加热块（Eppendorf，目录号：T1317-1EA）
7. ThermoMixer®C（Eppendorf，目录号：5382000015）
8. PCR热循环仪（Bio-Rad，型号：T100，目录号：1861096）
9. 台式离心机（赛默飞世尔科技公司，目录号：7500801）
10. NanoDrop（Thermo Scientific，型号：NanoDropTM 2000C，目录号：ND2000）
11. 琼脂糖凝胶电泳设备（Bio-Rad，目录号：1704489EDU）
12. 植物生长室（光周期：16小时光照/8小时黑暗，温度：白天22°C/黑暗20°C，湿度：65%，光强度：100μE m−2 s−1）
注：不需要特定制造商的设备。可以使用任何等效装置。

软件

1. 斯内普金（SnapGene，）®https://www.snapgene.com/
2. 图像实验室软件（Bio-Rad，）https://www.bio-rad.com/

程序

A、概述
CRISPR/Cas9产生双sgRNA定向大缺失的过程如图1所示。载体pKIR1.1可从Addgene订购。gBlock由U6启动子、基因特异性sgRNA原间隔区、sgRNA支架和终止子组成。

图1。游离Cas9靶突变体分离流程图。1生成两个gBlocks的克隆策略。2花浸法转化。三。用红色荧光筛选T1种子。4用红色荧光对T1植物进行基因分型和测序，以识别候选植物并从每株植物中收获种子。5分离不含Cas9的T2种子。6对T2植株进行基因分型以获得稳定和可遗传的空突变体。

B、生成两个gBlocks的中间边框
1. 设计两个gRNAs来靶向与CRISPRdirect相同的感兴趣基因（GOI）（Naito等人，2015）（图2）。

图2。双sgRNAs克隆策略综述。在pKIR1.1主干中引入两个GB锁的中间边界的克隆策略示意图。pHEE2E TRI含有两组gBlock1（U6-26启动子、19bp靶序列1、sgRNA支架、终止子）和gBlock2（U6-29启动子、19bp靶序列2、sgRNA支架、终止子）。因此，pHEE2E-TRI可以作为模板，用一对双sgRNA引物扩增中间边界（AarI-overhang1-protospacer1-scaffold-terminator-U6-29启动子protospacer2-overhang2-AarI）。经AarI酶切pKIR1.1质粒和中间边界后，中间边界可以整合到线性化的pKIR1.1主干中，生成pKIR1.1双sgRNA用于植物转化。

a、打开CRISPRdirect网页(http://crispr.dbcls.jp/)然后将目标基因组序列以FASTA格式粘贴到文本字段中，或者以高达10kb的纯核苷酸序列粘贴到文本字段中。
注：您还可以输入登录号（例如，NM_001187）或基因组位置（例如，hg19:chr7:900000-901000）来检索序列，或在FASTA中上载序列纯文本文件格式或不超过10 kb的普通核苷酸序列。
b、在“PAM序列要求”面板上选择NGG。
c、选择拟南芥基因组TAIR10为生物体。
d、单击“设计”。
e、点击“ShowHighly specific target only”，选择两个突出显示的protospacer序列，如下面的屏幕截图所示（图3）。

图3。gRNA选择。使用CRISPRdirect网页的gRNA选择示例屏幕截图。

注意：一个限制是避免原间隔序列上出现AarI限制位点。另外，目标序列可以从两条DNA链中选择，并且应该没有TTTTs。两个sgRNAs之间的距离取决于预期的缺失区域。S在拟南芥中，mall缺失（<100 bp）可以以相对较高的频率诱导，而较大的缺失（高达120 kb）可以以较低的频率诱导（Ordon等人，2016年）。5处的删除区域′非编码区的末端或3'端与屏幕截图相比，该序列没有出现频率差异（NC_003071.7:8122119-8123076拟南芥2号染色体序列）。 20nt原间隔区序列不必从G开始，因为我们的线性化质粒在U6启动子的3′端保留了一个G，作为在U6启动子处启动转录的第一个G。
2. 放大模板菲涅特里图的中间边界（图2）
a、从idtDNA订购正向和反向引物(https://www.idtdna.com/)并稀释至10μM的最终浓度。
双sgRNA1¬U F:5′-ATACATGN20GTTTTAGGAGCAAAATAGC-3′型CACCTGC公司
双-sgRNA2-u R:5′-atacaaacn20caatccttagtcactctac-3′CACCTGC公司
阿瑞：CACCTGC公司
20nt原间隔子1序列：N20
20nt原间隔子2反向补体序列：N20
黄色的悬垂1（ATTG）和悬挑2（AAAC）
橙色模板特定转发序列
绿色模板特定的反向序列
注：这里我们以屏幕截图中第一个和最后一个gRNA设计为例：
原间隔蛋白1:taaacgggaggactcac
CagAtcTgGaA2定位片
原间隔子2反向补体序列：CTTCAGATCTGACGATTCTGATTCTG
b、采用以下设置进行PCR扩增：
5x HF缓冲液5µl
dNTP（10毫米）1微升
双sgRNA1_F（10µM）1.25µl
双sgRNA2_R（10µM）1.25µl
三氟乙烷（100 ng/µl）1µl
普氏0.25微升
水15.25µl
总计25µl

PCR程序：
初始变性
变性
退火
延伸率
最终伸长率
保管部 98 摄氏度
98 摄氏度
57 摄氏度
72 摄氏度
72 摄氏度
4 摄氏度 30 s
10 s
30 s
17 s
5分钟
ꝏ

c、在琼脂糖凝胶上运行5µl PCR产物，以检查预期尺寸为620 bp的条带，并使用Wizard®SV凝胶和PCR清洁系统清理剩余的PCR产物。

C、将中间边界连接到pKIR1.1中（图2）
1. 消化和磷酸化PCR产物（中间边界）
a、用AarI在37℃下消化纯化的PCR产物6小时。
10x Aarl缓冲液5.0µl
中间边缘Xµl（=1.5µg）
AarI 1.5微升
50x低聚物1.0µl
水42.4–Xµl
总计50µl
注：50倍低聚糖包含用于刺激AarI活动的AarI识别序列(Grigaitė等人，2002年). 两者兼而有之10x Aarl缓冲器和50倍低聚糖提供赛默飞世尔公司的AarI酶。
b、在以下步骤中，将消化混合物在37°C下磷酸化30分钟，然后使用Wizard®SV凝胶和PCR清洁系统清理混合物。
消化混合物25µl
10x T4连接酶缓冲液2.83µl
T4多核苷酸激酶0.5µl
注意：跳过磷酸化步骤会降低连接效率。
2. 消化和去磷酸化pKIR1.1
a、在37°C下用AarI消化pKIR1.1 6小时。
10x Aarl缓冲液5.0µl
pKIR1.1 Xµl（=1.5µg）
AarI 1.5微升
50x低聚物1.0µl
水42.4–Xµl
总计50µl
b、用1μl磷酸酶（CIP）对pKIR1.1消化混合物进行脱磷，在37°C下脱磷30分钟，在80°C下脱磷10分钟。
消化混合物50µl
CutSmart®缓冲液（10x）5.67µl
CIP 1微升
c、用5µl消化混合物进行琼脂糖凝胶电泳，以测试消化物。消化后的pKIR1.1的预期大小约为18.5kb。使用SV®凝胶消化系统清洁和清洁SV®凝胶混合物。
注：我们建议使用pKIR1.1质粒作为阴性对照。消化后的线性质粒片段运行较慢，带宽较大，因此可以与阴性对照区区分开来。
3. 在16℃下用线性化的pKIR1.1结扎消化后的中间边缘30分钟，以生成最终载体pKIR1.1-双-sgRNA：
AarI消化的pKIR1.1载体Xµl（50 ng）
AarI消化中缘Xµl（5 ng）
10x T4连接酶缓冲液1.0µl
水Xµl
T4连接酶1.0µl
总计10.0µl
注：这里我们使用向量：插入摩尔比1:3。
4. 使用10µl连接产物转化大肠杆菌活性细胞，并用100 mg/l大观霉素将转化细胞铺在LB琼脂平板上，然后在37°C下将选择板培养过夜（克隆泰克提供转化方案：http://www.takara.co.kr/file/manual/pdf/trΒPT5055-2.pdf).
5. 选择8个菌落，使用正向引物Mlo 1938和您自己的原间隔区反向引物，通过菌落PCR验证正确插入（图4），设置如下：
含10mg2的hottaq-tm缓冲液
dNTP（10毫米）0.4微升
Mlo 1938（10µM）1µl
双sgRNA2_R（10µM）1µl
HotMasterTM Taq DNA聚合酶0.1µl
水15.5µl
用无菌移液管端取一个单菌落的一半，在PCR反应中旋转。
另一半用于接种。
总计20微升

PCR程序：
初始变性
变性
退火
延伸率
最终伸长率
保管部 94 摄氏度
94 摄氏度
57 摄氏度
65 摄氏度
65 摄氏度
4 摄氏度 2分钟
20 s
20秒
1分钟
5分钟

图4。菌落PCR产物的电泳。阳性菌落显示正确的插入大小为868bp。P、 C：阳性菌落，N.C:阴性菌落。

6. 阳性菌落接种于100 mg/L大观霉素LB培养基中过夜生长。
7. 用DNA质粒试剂盒提取质粒。
8. 对质粒进行测序，并用引物mlo1938验证中间边界插入的序列。

D、 pKIR1.1-双-sgRNA转化拟南芥
1. 用1μg pKIR1.1-dual-sgRNA转化有能力的tumefaciens GV3101细胞，并将转化细胞铺在添加有100 mg/L大观霉素、20 mg/L利福平、25 mg/L庆大霉素和25 mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上（Höfgen and Willmitzer，1988）。
2. 在30°C下生长两天后，如前所述，通过菌落PCR验证至少三个菌落中存在质粒。
3. 利用农杆菌介导的T-DNA转移和花浸法转化拟南芥植物（Clough and Bent，1998）。
注：每个构造，我们通常至少转化十种拟南芥植物。我们建议在转化前移除所有现有的硅线，以避免在转化之后对转化事件进行过度筛选。

E、 Cas9检测双sgRNA定向缺失
1. 将T1种子放在玻璃板中，用稍湿的牙签在立体荧光显微镜下用EL6000外部光源（放大倍数为10倍）和DsRED滤光片装置（激发，546/10 nm；发射，600/40 nm）拾取红色荧光种子（图5）。

图5。包含CRISPR/Cas9结构的T1种子的可视屏幕。pKIR1.1载体可以表达由RPS5A启动子驱动的s.p.Cas9蛋白，在包括生殖细胞在内的所有发育阶段都能实现高结构表达。pKIR1.1还包含一个OLE1-TagRFP（红色荧光蛋白）的表达盒，在种子中显示红色荧光。因此，含有CRISPR/Cas9结构的转化子在T1种子中可以观察到红色荧光。比例尺=1毫米。
注：该转换效率t他的系统在2.5%左右，可以在10分钟内拾取25个红色T1种子。

2. 基因型：通过分离叶片基因组DNA（gDNA）和随后的PCR（Edwards等人，1991年），利用缺失位点两侧的寡核苷酸（±300-500 bp上游和下游）在种子中观察到T1植物的靶向缺失（图6）：

图6。基因分型双sgRNA诱导的GOI突变。在缺失位点两侧有一对引物（引物F和引物R）可以检测到GOI的大缺失。与野生型相比，在goi突变体中可以检测到较短的扩增子大小。

10倍HotMasterTM Taq缓冲液，含Mg2+2µl
dNTP（10毫米）0.4微升
底漆F（10µM）1µl
底漆R（10µM）1µl
叶gDNA 1µl（10 ng）
HotMaster Taq DNA聚合酶0.1µlTM公司
水14.5µl
总计20µl

PCR程序：
初始变性
变性
退火
延伸率
最终伸长率
保管部 94 摄氏度
94 摄氏度
变量
65 摄氏度
65 摄氏度
4 摄氏度 2分钟
20 s
20秒
1分钟/1 kb
5分钟
ꝏ

F、分离Cas9游离遗传突变
1. 从不同基因型的T1植株中采集T2种子，在立体荧光显微镜下进行第二轮观察，以选择理想的后代。不含CRISPR/Cas9结构的T2种子可以被识别，因为它们缺乏红色荧光并被分离出来。
2. 基因型10不含Cas9的T2植株，用phusion聚合酶在缺失位点两侧使用寡核苷酸进行PCR（图7）。
5x HF缓冲液5µl
dNTP（10毫米）1微升
底漆F（10µM）1.25µl
底漆R（10µM）1.25µl
叶gDNA 1µl（10 ng）
普氏0.25微升
水15.25µl
总计25µl

PCR程序：
预变性
变性
退火
延伸率
最终伸长率
保管部 98 摄氏度
98 摄氏度
变量
72 摄氏度
72 摄氏度
4 摄氏度 30 s
10 s
30 s
30秒/1 kb
5分钟
ꝏ

3. 在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用Wizard®SV凝胶和PCR清洁系统从凝胶中提取正确尺寸的缩短goi条带。
4. 对PCR产物进行Sanger测序，验证goi突变序列。通常，在缺乏Cas9活性的植物中，选择缺乏荧光报告子的种子后，可以识别出遗传缺失事件。

数据分析

测序数据可以用软件SnapGene与野生型序列比对分析。T2的goi突变体产生大的缺失（图7）。

图7。goi突变体PCR产物的代表性色谱图。A、显示红色荧光的单个T1植物的基因分型。红框中的goi-3显示两个带，WT-goi-amplicon和goi-amplicon。这种具有代表性的goi突变体具有预期的229bp缺失，是通过靶向基因组区域Chr2:8122228-8122453的双sgRNA产生的。重量为1kb的PCR产物表示没有GOI的缺失。B、在T2代，收集T1-goi-3的种子并进行生长，以筛选不含Cas9的植物。红色框中的goi3-10（种子中没有红色荧光）只显示了预期的goi扩增子大小。C、对T3代goi-3-10大苗进行基因分型。顶部，只有预期的goi扩增子被扩增，表明是可遗传的纯合缺失。底部，没有扩增Cas9特异带（406bp）验证了基于荧光的反选择Cas9转基因。以T2代的goi-3（无荧光选择）和WT分别作为阳性对照和阴性对照。D、 GOI（∆229bp）代表性缺失片段序列。对齐是用SnapGene生成的。PAM是蓝色的，sgRNA原间隔区是红色的，删除的碱基被goi3-10中的破折号代替。
注：必须仔细检查测序色谱图，并检查是否存在重叠峰。重叠峰是测序样本遗传异质性的标志。

食谱

1LB液体介质1LB液体介质
10 g/L巴托胰蛋白酶
5g/L酵母抽提物
5 g/L氯化钠
2. LB琼脂培养基
10 g/L巴托胰蛋白酶
5 g/L酵母提取物
5 g/L氯化钠（NaCl）
平板用15 g/L巴氏琼脂
3. ½MS中板
4.4 g/L Murashige和Skoog培养基
0.5克/升MES
10 g/L蔗糖
用KOH将pH调至5.7
10 g/L平板植物琼脂

致谢

这项工作由诺和诺德基金会NNF15OC0014202、哥本哈根植物科学中心青年调查员启动赠款和欧洲研究理事会（ERC）根据欧盟地平线2020研究和创新计划StG2017-757411（s.M.）资助。

相互竞争的利益

没有相互竞争的利益。

工具书类

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