材料和试剂

1 15 ml聚丙烯培养管（VWR，目录号：82050-274，项＃187262）
注意：可以来自任何来源。

2 25 ml血清移液管（VWR，目录号：89130-912）
注意：可以来自任何来源。

3 50 ml锥形螺旋盖管（Fisher Scientific，目录号：0553913）
注意：可以来自任何来源。

4 1.5 ml螺帽管（Fisher Scientific，目录号1415-8700）
注意：可以来自任何来源。

5 无RNase的1.5 ml离心管（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：14-666-319）
注意：可以来自任何来源。

6 250 ml 0.1 µm PES膜真空过滤装置（Fisher Scientific，目录号：09741201）
注意：可以来自任何来源。

7 Cuvettes PS Semi-micro（VWR，目录号9700-586）
注意：这取决于要使用的细胞培养物的OD 600的测量方法。

8 Uvette 220-1600 nm（Eppendorf，目录号：952010051）
注意：这取决于定量纯化RNA的方法。

9 0.5毫米氧化锆/二氧化硅破碎珠（国际研究产品，目录号：9834）
按照制造商的说明进行灭菌和消除核酸污染，并在-20°C下保存

10 MF- Millipore TM 0.45 µm，直径47 mm的网格滤膜（Merk Millipore Ltd.，MF- Millipore TM ，目录号：HAWG04700）
11 相关的白色念珠菌菌株（本例中使用作者构建的SC5314和SC5314衍生的efg1Δ :: HIS1突变株）
12 酵母提取物（BD，Bacto TM ，目录号：212750）
13 蛋白ept （BD，Bacto TM ，目录号：211677）
14 葡萄糖（Sigma Life Science，目录号：D9434-1KG）
15 RPMI 1640（Sigma-Aldrich公司，目录号：R4130-10L），小号撕4 ℃下
16 胎牛血清的高级（亚特兰大生物制品，R＆d系统，目录号：S11150H），小号撕在-20℃下
17 苯酚：氯仿：异戊醇（Sigma公司生命科学，目录号：77617-100ml），小号撕在4℃下
18 Qiagen RNEasy迷你套件（Qiagen，目录号：74104）
19 NaOH盐（Sigma-Aldrich，目录号：221465-500G）
注意：可以来自任何来源。

20 100％纯乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023-1L ）
注意：可以来自任何来源。

21 去离子H 2 O（任何来源）
22 β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：444203-250mL）
注意：可以来自任何来源。

23 YPD液体生长培养基（请参阅食谱）
24 10 N NaOH（请参阅食谱）
25 RPMI + 10％FBS（请参阅食谱）

设备

1 125毫升玻璃烧瓶（Fisher Scientific，目录号：FB501125）
注意：可以来自任何来源。

2 30°C培养箱（任何来源）
3 旋转鼓过夜培养物（新不伦瑞克科学，米Odel等：TC-7，目录号：M1053-4004）
注意：此产品已停产，但可以替代可达到60-70 rpm的类似转子。

4 Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计® D30仪（Eppendorf，目录号：6133000010）
注意：这可以替代另一台具有类似功能的分光光度计。

5 摇动培养箱37°C（New Brunswick Scientific，Eppendorf，型号：I-26，货号：M1324-0000）
注意：这可以替代另一台具有类似功能的振荡培养箱。

6 微量离心机（Thermo Scientific ，型号：Sorvall Legend Micro 21，目录号：75002436）
注意：这可以取代另一微量即能在≥旋转17000×g离心。

7 1-2升侧臂锥形烧瓶（任何来源）
8 MiniBeadBeater-16（BioSpec产品，型号：607）
注：牛逼，他的作者并没有试图将该协议与其他类型的玻珠打击的，但是具有类似规格类似的水平玻珠打击将最有可能产生类似的结果。

9 Millipore 47毫米玻璃底座和塞子（Millipore，目录号：XX1014702）
10 50 ml锥形管架（任何来源）
11 -80 °C和-20°C冰箱（任何来源）
12 4°C冰箱或冷藏室（任何来源）
13 标准台式涡旋仪（任何来源）
14 钳子

程序

注意：此程序以突变体和野生型（WT）两种菌株的体积和数量编写，每组三个重复，共六个独立样品。

A 细胞培养和收获
1.在5 ml液体YPD中接种WT和突变菌株，并在30°C旋转60 rpm孵育过夜。

2.预热200 ml RPMI + 10％FBS并在125°C的无菌无菌锥形瓶中在37°C下过夜（O / N），或在步骤A3之前最少放置2 h，然后花更多的时间进行大体积处理。

3.将25 ml预热的RPMI + 10％FBS分装到6个预热的125 ml烧瓶中的每一个中，并在首次接种之前至少回到90 °C的恒温箱，以稳定温度90分钟。

4.彻底涡旋O / N WT培养，使用Eppendorf BioPhotometer和Cuvettes PS Semi-micro测量OD600 ，并从O / N WT培养物中接种第一个预保温的RPMI + 10％FBS烧瓶，使最终OD600为0.2。

5.立即转移到I-26空气振荡器培养箱中，在37°C和225 rpm旋转下保持4 h。在30°C孵育中替换O / C。

6.重复接种之间等待8-10分钟。

注意：此间隙是为了留出足够的时间在两次重复之间进行细胞收获。可以根据需要缩短或延长时间，以允许执行协议的人员的工作速度。

7.对于WT重复2和3以及突变重复1-3，重复步骤A4-A6 。

8.这大约需要3个小时，直到第一个培养物准备好收获。借此机会来建立细胞收集设备。

a 将1-2 L侧臂烧瓶连接到真空管线，并收集并安装Millipore 47毫米玻璃底座和塞子，以便在烧瓶顶部进行真空过滤。
b 开启真空并用dH 2 O洗涤滤网2次，并用70％乙醇洗涤2次，以清除碎屑并让滤网干燥，然后再使用滤膜。
c 在-80°C下冷却50 ml锥形管架。
d 在冰中预冷并标记6个50 ml锥形螺口管。
9.在4小时的时间点之前，使用无菌平口钳将MF- Millipore TM 0.45 µm，直径47 mm的网格状滤膜朝上过滤，使基础网格面朝上，并打开真空（图1）。

图1.细胞收集过滤设置。将Millipore 47毫米玻璃底座和塞子插入侧臂烧瓶中并连接到真空管线。在真空运行下，用水和70％乙醇彻底清洗玻璃基底，并使其干燥。将MF- Millipore TM 0.45 µm，直径47 mm的网格滤膜放在玻璃底座上。建议使用在线捕集器和过滤器，以免浪费。

10.在4 h时，从振荡器中取出WT复制1烧瓶，并轻轻旋转以移出粘在烧瓶侧面的细胞。

11.迅速用25 ml血清移液管将整个培养物转移至滤膜，速度应尽可能快，而不会使真空膜溢出。

12.一旦液体从细胞中移出，请使用无菌平刃镊子将滤膜转移至预冷的50 ml锥形管的底部，并立即置于-80°C的冰箱中。

13.如前所述，用dH 2 O和70％的乙醇清洗滤清器底座。

14.对于其余的WT和突变体重复序列，重复步骤A9-A13。

注意：这些步骤是时间敏感的。对于精确的表达数据而言，缩短细胞孵育至-80°C冷冻之间的时间至关重要。

15.将细胞在-80°C下孵育至少1 h，以确保将其冷冻后再进行RNA提取。

注意：细胞在此阶段可以稳定几天到几周，因此，如果需要大量样品，则可以在提取RNA之前的数天内将细胞培养和收获分离。

B RNA提取和定量
1.将30 0 µl 0.5 mm氧化锆/二氧化硅破裂珠和600 µl 25：24：1苯酚：氯仿：异戊醇等分装到1.5ml螺帽管中，并在4 °C冷却至少1 h（每个细胞培养1个管）复制）。每个样品准备新鲜的600 µl RLT（Qiagen RNeasy Mini试剂盒）+ 1％β-巯基乙醇（BME），并在冰中预冷。预先冷却2毫升无菌卫生署2 ö每在冰上的样品。在冰上预冷1.5 ml微量离心管（每个样品1个）。

注意：步骤B2-B10必须在4°C下完成。将材料放在冰上或在冷藏室中工作。

2.从-80°C冰箱中取出50 ml装有滤膜和细胞的锥形管，在冰上融化10分钟。

3.用900 µl冷冻无菌dH 2 O将细胞从滤膜上洗下来，并以最高速度涡旋30 s。将悬浮液转移至冷却的1.5 ml微量离心管中，并置于冰上。

4.第二次用额外的900μl冷冻无菌dH 2 O洗涤过滤器，并以最高速度涡旋30 s。将悬浮液转移到相同的1.5 ml冷冻离心管中，置于冰上。

5.对每个样品使用新的试管，对所有样品重复步骤B3和B4。

6.在标准台式微量离心机中以最大速度（≥17,100 xg ）离心30 s，并弃去上清液。

7.加入600 µl准备好的RLT + 1％BME溶液，并以最大速度涡旋重悬。

8.将600 µl细胞悬液转移至装有氧化锆珠和苯酚：氯仿：异戊醇的冷螺帽管中。

9.使用BioSpec MiniBeadBeater-16 607型在4°C下拍打3分钟。

10.在标准台式微量离心机中，在4°C下以最大速度将细胞离心8分钟。

11.将550 µl水层转移至新的无RNase的1.5 ml微量离心管中，加入550 µl 70％EtOH，颠倒6次进行混合。

注意：如果没有550 µl水溶液，则测量并转移到新管中，并加入等体积的70％乙醇。

12.转移到700微升样品，以RNeasy旋转柱并离心15秒的在≥ 8000 ×g离心。丢弃流通。用剩余的样品重新装填色谱柱，然后再次旋转以丢弃流通液。

注意：Qiagen RNeasy迷你试剂盒规程中提供了步骤B12-B17中提到的所有耗材，用于从酵母中纯化总RNA。该协议的步骤B12-B16与Qiagen RNeasy Mini Kit协议从酵母中纯化总RNA的步骤2-5相同。

13.将700 µl RW1缓冲液添加到色谱柱中，并在≥8,000 xg的转速下旋转15 s 。丢弃流通。

14.将500 µl缓冲液RPE（添加了乙醇）添加到色谱柱中，并以≥8,000 xg的转速旋转15 s 。丢弃流通。

15.重复步骤B14。

16.将旋转柱转移到新的收集管中，并以≥8,000 xg旋转1分钟。丢弃流通。

17.将旋转柱转移至RN的无硒1.5 ml微量离心管（来自试剂盒）。向柱膜中加入40 µl无RNase的水，并以≥8,000 xg离心1分钟。

18.取40μL从步骤B17和洗脱液在≥再次重新应用到离心柱膜和旋转1分钟8000 ×g离心。

注意：这不是严格必要的，但是会增加总浓度。

19.立即在-80°C下冷冻样品进行保存。

20.为了定量RNA和评估纯度，制备1：总RNA和测量OD 500稀释260使用的Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计和Uvette 220-1 ，600个纳米比色皿。

注意事项：

平均产量通常超过2 µg / µl，最高约为6 µg / µl。260/280和260/230值通常分别在2.0-2.2和2.5-2.5之间。
根据可用的设备，可能不需要稀释和使用Uvettes 。

笔记

1 编写此方案可容纳6个样品（2个菌株，每个菌株3个重复样品），但是可以扩展，因为它可以在收获的细胞被冷冻的同时延长数天。它也可以适应RPMI + 10％FBS以外的任何介质条件。但是，如果添加更多的复制品和菌株，建议如果可能的话，提前制作大批培养基，以消除批次对菌株转录谱的影响。例如，在这里我们要求为6个样品提供200 ml的RPMI + 10％FBS，这需要额外的50ml。如果需要60个样品，则应大批量配制1.5 L RPMI + 10％FBS，然后分装成较小的单元，在几天内使用。
2 该协议不包括DNase处理。这意味着最终产品可能会有一些DNA污染。Qiagen RNeasy Mini Kit旋转柱通过设计可防止大多数DNA残留，但可能会残留残余DNA。如果必须避免DNA污染用于下游应用，则可以在S teps B 12和B 13之间的旋转柱上或在最终洗脱后进行DNase处理，有关此操作的规程可以在Qiagen RNeasy Mini Kit规程中找到。

菜谱

1 YPD液体生长培养基
用500 ml dH 2 O溶解20 g葡萄糖，20 g蛋白ept和10 g酵母提取物
用dH 2 O将体积升至1 L
高压灭菌器消毒
2 10 N氢氧化钠
将40 g NaOH溶解在50 ml dH 2 O中
用dH 2 O将体积提高到100 ml
3 RPMI + 10％胎牛血清
a 将3.28 g RPMI1640粉末溶于180 ml dH 2 O
b 使用10 N NaOH（大约180 µl）将pH调整至7.4
c 通过真空过滤灭菌RPMI溶液
d 在37°C水浴中解冻胎儿牛血清精华（FBS）
注意：FBS制造商建议避免重复的冻融循环，因此要进行相应的计划。

e 轻轻摇动以重悬所有固体
f 将20毫升融化的FBS加入200毫升RPMI溶液中，并轻轻摇晃以免起泡沫
g 储存在4°C下长达一个月

致谢

NIH赠款1R21AI144878-01和1R01AI146103 （PI：Mitchell）支持在此实验室中对白色念珠菌RNA的研究。该协议从1988年以来在Mitchell实验室中使用的协议演变而来。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考文献

1 Rodríguez，A.，Vaneechoutte ，M.（2019年）。比较不同细胞裂解方法和商业方法从RNAlater中存储的白色念珠菌提取RNA的效率。BMC Microbiol 19（94）。
2 铃木T.和岩桥Y.（2013年）。使用消化方法制备啤酒酵母的RNA可能会产生误导性的结果。应用生物化学生物技术。169（5）：1620-1632。
3 Dikicioglu ，D.，Karabekmez ，E.，Rash，B.，Pir ，P.，Kirdar ，B.和Oliver，SG（2011）。酵母如何根据不同的营养素冲动重新编程其转录谱。BMC Syst Biol 5：148。
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