材料和试剂

1.移液器吸头（任何品牌）
2. 100毫米细胞培养皿（IWAKI，目录号：4020-010）
3. 50 ml管（FALCON，目录号：352070）
4. 1.5 ml管（BIO-BIK，目录号：RC-0150）
5.三（羟甲基）氨基甲烷（的Tris 。盐酸）（NACALAI TESQUE ，目录号：35409-45 ）
6. Triton TM X-100（Sigma，目录号：T8787）
7.不含Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水[PBS（-）]（NACALAI TESQUE，目录号：1148215）
8.蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad，目录号：500-0006）
9.十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP166500）
10. β-巯基乙醇（赛默飞世尔科技，产品目录号：BP176-100）
11. HEPES（NACALAI TESQUE，目录号：17546-05）
12.氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
13.甘油（NACALAI TESQUE，目录号：17018-25）
14. 4 - 20％的Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白凝胶（Bio-Rad公司，目录号：4561093）
15. SilverQuest TM银染试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：LC607）
16.蛋白质标记物（Bio-Rad ，Precision Plus Protein TM标准品-双色，目录号：1610374）
17.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10270106）
18. RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875093）
19.的Benzonase ®核酸酶（Novagen公司，目录号：70746-3）
20. cOmplete TM ，不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（罗氏，目录号：4693132001）
21. GFP-陷阱®琼脂糖（Chromotek ，目录号：GTA-20）
22. ANTI-FLAG ® M2琼脂糖（Sigma，目录号：A1205）
23. 3个FLAG TM肽（Sigma，目录号：F4799）
24.六水合氯化镁（NACALAI TESQUE ，目录号：7791-18-6 ）
25.二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14112-52）
26.溴酚蓝（西格玛奥德里奇，目录号：B5525）
27.甘氨酸（NACALAI TESQUE ，目录号：17109-35 ）
28.甲醇（和光纯药工业，目录号：136-09475）
29.快速CBB染色（和光纯药工业株式会社，目录号：299-50101）
30.网织红细胞标准缓冲液（RSB）（请参阅食谱）
31. HEPES-甘油-NaCl（HGN165）（请参阅食谱）
32.蛋白酶抑制剂鸡尾酒（25倍）（请参阅食谱）
33.裂解缓冲液1 （LSB1）（请参阅食谱）
34.裂解缓冲液2（LSB2）（请参阅食谱）
35.裂解缓冲液3（LSB3）（请参阅食谱）
36.裂解缓冲液4（LSB4）（请参阅食谱）
37.洗涤缓冲液（请参阅食谱）
38. FLAG TM洗脱缓冲液（请参见配方）
39. 2x-SDS样本缓冲区（请参阅食谱）
40. 4x-SDS样本缓冲区（请参阅食谱）
41. 10x-SDS-PAGE运行缓冲区（请参阅食谱）
42.半干Western印迹缓冲液（请参见食谱）

配套设备

移液器（任何品牌）
冷藏摆桶式离心机（Tomy ，型号：EX-136）
冷藏定角离心机（Tomy ，型号：MX-301）
振动培养箱（TAITEC，型号：BR-23FP）
旋转器（TAITEC，型号：RT-50）
超声波仪（Diagenode ，型号：Bioruptor ®标准UCD-200）
涡旋混合器（Thermo Fisher Scientific，目录号：128101）
块状加热器（任何品牌）
磁力架（Thermo Fisher Scientific; DynaMag TM -2，型号：12321D）
Western印迹装置（B IO - - [R广告，型号：反式印迹® SD半干转移细胞，目录号：1703940）
蛋白电泳系统（B IO - - [R广告，该迷你- PROTEAN ®利细胞，目录号：1658005EDU）
免疫印迹成像（GE H ealthcare，型号：ImageQuant LAS 4000）

程序

核裂解液的制备
在50 ml锥形管中用培养基收集2 x 10 7 -3 x 10 7个细胞，并在4°C下以800 xg离心3分钟。
丢弃上清液，将细胞悬浮在10 ml的预冷PBS中，并在4°C下以800 xg离心3分钟。
丢弃上清液，将细胞悬浮于1 ml的预冷PBS中，并转移至1.5 ml试管中，并在4°C下以800 xg的速度离心细胞3分钟。
丢弃上清液，将细胞悬浮于950 µl含1x蛋白酶抑制剂混合物的预冷RSB中，并在冰上孵育15分钟。
加入20 µl 10％Triton TM -X100（v / v），颠倒试管6-10次，并在4°C下以1,200 xg离心5分钟。
弃上清（细胞质级分），暂停在200μl预冷LSB1的核沉淀并温和超声处理在Bioruptor ®用于在低功率下5分钟（脉冲30秒，休息60秒）。在冰上放置5分钟，然后在低功率下重复超声5分钟（脉冲30 s，休息60 s）。在4°C下颠倒旋转1 h。
在4°C下以8,000 xg离心10分钟，然后将上清液收集在新的试管（S1）中。
立即用移液器吸头将沉淀物悬浮在150 µl预冷的LSB2中，并在4°C下颠倒旋转30分钟。
在4°C下以8,000 xg离心10分钟，然后在新管中收集上清液。在S2中加入50 µl含1x蛋白酶抑制剂混合物的RSB，并置于冰上（S2）。
立即用移液器吸头将沉淀物悬浮在150μl的预冷LSB3中，并在4°C下颠倒旋转30分钟。
在4°C下以8,000 xg离心10分钟，并在新管中收集上清液。向S3加入50 µl含1x蛋白酶抑制剂混合物的RSB，并置于冰上（S3）。
立即用移液器吸头将沉淀物悬浮在150μl的预冷LSB4中，并在4°C下颠倒旋转30分钟。
在4°C下以8,000 xg离心10分钟，并在新管中收集上清液。将100 µl含1x蛋白酶抑制剂混合物的RSB加入S4，并置于冰上（S4）。
池提取S1，S2，S3和S4。颠倒几次以混合并在4°C下以3,000 xg离心5分钟，然后将上清液收集在新的试管中。保存30 µl合并提取物，添加30 µl 2x SDS样品缓冲液，并在95°C加热10分钟。这将用作蛋白质印迹的输入。

免疫共沉淀
转移30 μ GFP-陷阱的升®琼脂糖的GFP融合蛋白或30 μ升FLAG ® -M2琼脂糖FLAG ® -标记的蛋白以1.5ml试管中。
添加500 μ的升预先冷却在RSB，转化4-6次，和离心机800 ×g离心3分钟，在4℃。小心丢弃上清液，不要干扰树脂。
转移核汇集裂解物加入到洗涤GFP-陷阱®琼脂糖或FLAG ® -M2琼脂糖和旋转翻滚式端1-2小时，在4℃。
在4°C下以80 xg离心3分钟，并弃去上清液。在这个阶段低速离心防止可能过程中形成的不溶性蛋白质聚集体的沉淀用温育裂解物GFP-陷阱®或FLAG ® -M2琼脂糖，在4℃。小心丢弃上清液，不要干扰树脂。
要洗涤树脂，请加入800 µl预冷的WB，颠倒8-10次，在4°C下以800 xg离心3分钟，并小心弃去上清液，而不会干扰树脂。
再重复洗涤3次，并小心弃去上清液，不要干扰树脂。继续洗脱结合的蛋白质。

洗脱液
沸腾洗脱
将树脂悬浮在100 µl 2x SDS样品缓冲液中，并在95°C加热10分钟。
在25°C下以1,800 xg离心3分钟，然后将上清液收集在新的试管中。
竞争洗脱
暂停树脂在75微升的3倍FLAG ®洗脱缓冲液含有500微克/毫升的3倍FLAG ®肽在25 ℃下为20分钟，用轻度振摇。
在25°C下以1,800 xg离心3分钟，然后将上清液收集在新的试管中。
加入25 µl 4x SDS样品缓冲液，并在95°C加热10分钟。

免疫沉淀蛋白分析
在SDS-PAGE凝胶上运行5-10 µl输入裂解物和10 µl洗脱液（带有SDS样品缓冲液），然后进行蛋白质印迹。
对于银染，在SDS - PAGE凝胶上运行2-3 µl输入的裂解物和10 µl洗脱液（使用SDS样品缓冲液），并用SilverQuest TM Silver染色试剂盒（Invitrogen）染色。
为了通过质谱鉴定蛋白质，可以合并4-10次Co-IP实验的洗脱液。要将合并的洗脱液加载到SDS-PAGE的一个泳道中，可以使用利用MS兼容试剂的方法（例如基于甲醇/氯仿的方法）浓缩合并的洗脱液。在4-20％SDS - PAGE梯度凝胶SDS-PAGE凝胶上运行浓缩的蛋白质，并用Quick-CBB染色。将凝胶泳道切成8-10片，进行MS分析。

笔记

在第一个实验中，检查要在沉淀级分（S1至S4）和不溶性沉淀物中免疫沉淀的蛋白质的提取（图1）。如果没有看到足够的萃取，请添加更多具有较高Triton TM X-100和/或NaCl浓度的萃取步骤。同样，如果用低严格度缓冲液充分提取蛋白质，则可以省略高严格度缓冲液的提取。
使用针对目标蛋白质靶标的一抗，在该方案中制备的合并裂解物也可用于Co-IP。
在室温下测量每种缓冲液的pH 。

菜谱

网织红细胞标准缓冲液（RSB）
10 mM Tris-HCl，pH 7.4
5毫米MgCl 2
10毫米氯化钠
HEPES-甘油-NaCl（HGN165）
10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4
10％甘油（v / v）
165毫米氯化钠
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（25X）
将1片不含EDTA的cOmplete TM蛋白酶抑制剂鸡尾酒溶解在0.4毫升水中
裂解缓冲液1（LSB1）
HGN165
2毫升
Triton TM X-100（10％v / v）
20微升
氯化镁2 （0.5 M）
8微升
DTT（50万）
4微升
的Benzonase ® （250个单位/ μ升）
4微升
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（25x）
130微升
裂解缓冲液2（LSB2）
LSB1
500微升
的Triton TM X -100（10％V / V）
10微升
裂解缓冲液3（LSB3）
LSB1
500微升
氯化钠，1 M
26.5微升
裂解缓冲液4（LSB4）
LSB1
500微升
氯化钠，1 M
53微升
洗涤缓冲液（WB）
HGN165
6毫升
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（25x）
240微升
FLAG TM洗脱缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.5
150毫米氯化钠
0.1％Triton TM X-100（v / v）
2个SDS样本缓冲区
120 mM Tris-HCl，pH 6.8
20％甘油（v / v）
2％SDS （w / v）
0.04％溴酚蓝
10％β-巯基乙醇（v / v）
4个SDS样本缓冲区
120 mM Tris-HCl，pH 6.8
40％甘油（v / v）
4％SDS （w / v）
0.08％溴酚蓝
20％β-巯基乙醇（v / v）
10x-SDS-PAGE运行缓冲区
Tris基地
30.3克
甘氨酸
188克
安全数据表
10克
水
至1升
半干蛋白质印迹缓冲液
Tris基地
6克
甘氨酸
14.4克
安全数据表
1克
甲醇
200毫升
水
至1升

致谢

我们是感激的对财政支持来自日本科学（KAKENHI 15H05784）促进和协作研究资助与小野制药有限公司TH和格兰特在急救的科学研究（C）日本科学促进会（NAB）的编号为16K07214。在IP协议被改编自Husain的等人。（2016）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

参考文献

ħ乌塞恩，A.，卡莉达，NA，谷口，T.，谷口，H.，小林，M。和本庄，T。（2016）。染色质重塑剂SMARCA4募集拓扑异构酶1并抑制转录相关的基因组不稳定。Nat Commun 7：10549。
Kim，N.和Jinks-Robertson，S.（2012年）。转录是基因组不稳定的来源。Nat Rev Genet 13（3）：204-214。
小林，M.，艾达，M.，长冈，H.，卡莉达，NA，北胁，Y.，中田，M.，Stanlie ，A.，土井，T.，加藤，L.，冈崎，IM，Shinkura ， R.，Muramatsu ，M.，Kinoshita，K. and Honjo ，T.（2009）。AID诱导的拓扑异构酶1减少诱导DNA结构改变和DNA裂解，从而实现类开关重组。PROC国家科科学院科学USA 106（52）：22375-22380。
Kobayashi，M.，Sabouri ，Z.，Sabouri ，S.，Kitawaki ，Y.，Pommier ，Y.，Abe，T.，Kiyonari ，H.和Honjo ，T.（2011）。拓扑异构酶I的减少负责激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）依赖的体细胞超突变。PROC国家科科学院科学USA 108（48）：19305-19310。
Pommier ，Y。（2006）。拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱及其他。Nat Rev Cancer 6（10）：789-802。
Smith，AL，Friedman，DB，Yu，H.，Carnahan，RH and Reynolds，AB（2011）。ReCLIP（可逆交联免疫沉淀）：一种审讯不稳定蛋白质复合物的有效方法。公共科学图书馆· ONE 6 ：e16206。