设备

常规Windows或Mac OS X笔记本电脑或台式机。
注意：不需要特殊的处理器或RAM，但是可以通过同时打开有限数量的文件来避免内存问题。概述的协议是在安装有进行笔记本电脑的Windows 10，英特尔的Core i5-8265U处理器，CPU @ 1.60GHz的和的8 GB RAM。

软件

MAFFT版本7在线服务（Katoh等人，2002和2019）（可从https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/closelyrelatedviralgenomes.html获得）
AliView版本1.26 （2014年，拉尔森）（可从https://ormbunkar.se/aliview/获得）
序列操作套件版本2 （Stothard，2000）（可从https://www.bioinformatics.org/sms2/rev_comp.html获得）
SequenceTracer （Nagy等人，2019）（可从http://www1.szu.cz:8080/EntropyCalcWeb/sequences获取）。
ElimDupes（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/elimdupesv2/elimdupes.html）
PNNS计算器（可从http://entropy.szu.cz:8080/EntropyCalcWeb/pnns获得）
网络浏览器（例如Google Chrome或Mozilla Firefox）
文本编辑器（例如Microsoft记事本）。

程序

你可以跳牛逼Ø程序d下载最新versio一个随时可以使用的SARS-COV-2多序列A的ñ FR lignment（MSA）文件上的OSF OM我们的项目页面。

病毒序列数据库
从您选择的存储库中下载病毒序列。
注意：请检查每个存储库的条款和条件，并注意数据共享策略。可能需要注册。
全球共享禽流感数据倡议组织的EPICO V数据库（https://www.gisaid.org/）（舒和麦考，2017年）。
NCBI病毒（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/）（孵化器等，2017）。
中国国家基因组学数据中心（NGDC）数据库（https://bigd.big.ac.cn/ncov）（NGDC，2020年）。
EMBL-EBI的COVID-19数据门户（https://www.covid19dataportal.org/）。
英国COVID-19基因组学（COG-UK）联盟（https://www.cogconsortium.uk/data/）。
下载武汉-Hu-1的完整基因组（NCBI参考序列：NC_045512.2；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）。

使用专用于紧密相关病毒基因组MSA的MAFFT在线服务进行多序列A修饰（MSA）（https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/closelyrelatedviralgenomes.html）。
输入端（图URE 1 A）：
武汉-Hu-1（NC_045512.2）的完整基因组到“现有比对”框中。
将其他序列输入“片段序列”框中。
注意：MAFFT在线服务最多支持20,000个序列，长度约30 kb。如果要比对更多序列，则应分批执行任务，并且应在序列分层后合并结果。
参数（图1 B）：
大写/小写，选择“与输入相同”。
核苷酸序列的方向，选择“根据第一个序列调整方向”。
输出顺序，选择“对齐”。
高级设置（图1 C）：
保持对齐长度，选择“是”。
策略，选择“自动” 。
一旦可用，以FASTA格式下载比对序列。

Figu重1 。使用MAFFT在线服务的多序列比对（MSA）

程序AB的视频：https : //youtu.be/hbnsXnikRak

或者，从我们的OSF页面（https://doi.org/10.17605/OSF.IO/NPCS6）下载即可使用的MSA文件。
注意：我们原始出版物（Khan和Cheung，2020年）中的数据是从GISAID下载的，不允许公开发布MSA文件。我们OSF页面上提供的MSA文件是使用从NCBI病毒下载的序列生成的。该文件将在大流行期间定期更新（文件1对齐19863 SARS-CoV-2序列）。

将每个引物/探针的感兴趣区域（ROI）保存为单独的FASTA文件
从AliView程序中的过程B或过程C打开MSA文件。
注意：Aliview程序（可从https://ormbunkar.se/aliview/获得）需要预先在计算机上下载。
使用“查找”功能（图2 A）或使用“从剪贴板添加和比对序列”功能（图2 B）查找引物结合位点。
使用序列操作套件（https://www.bioinformatics.org/sms2/rev_comp.html），根据需要对引物/探针序列进行反互补。
> CN-CDC-N_F
GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

FIGUR ê 2 。翅片定感兴趣区域（ROI）的MSA

选择ROI并复制选择为FASTA格式（图URE 3 A）。
打开一个新文件，“粘贴（fasta序列）”和“保存”（图3 B）。该序列可以粘贴在文本编辑器中，并保存为FASTA文件。

图3 。将每个引物/探针的关注区域（ROI）保存为单独的FASTA文件

程序D的视频：https : //youtu.be/H9UxkgAsMdE

序列分层：选项1 – SequenceTracer。
将单个FASTA文件上传到SequenceTracer并单击“提交”（图4 A）（http://www1.szu.cz:8080/EntropyCalcWeb/sequences）。所述SequenceTracer偏析数据到相同的序列的离散组变体，并提出在每个ROI中的核苷酸变异的与每个变体的频率沿的详细视图。此外，将表示不明确序列的序列分组为“ outgroup1”，将短序列分组为“ outgroup2”，将缺失序列分组为“ excluded”。
下载显示序列变体列表和/或图表的分层数据（图4 B）。

FIGUR ê 4 。使用SequenceTracer进行序列分层

视频为科技教育p小号E1- ê 2：https://youtu.be/ysT_KBXkpvw

的“分层”文件可以使用Microsoft Excel而“压缩”的文件可被打开打开全光照克AliView程序或文本编辑器（图5 ）。
可以下载任何序列变异组的数据（图6 ）。
首先，选择组。
然后，“全部添加到便笺” 。
最后是“导出” 。

FIGUR ê 5 。SequenceTracer的预期结果
图片包含图形用户界面描述自动生成
FIGUR ê 6 。下载特定变体组的数据

视频的步骤小号E3- è 4：https://www.youtube.com/watch?v=4S0T9TW5ax4

序列小号tratification：选项2 - ElimDupes。
将单个FASTA文件上传到ElimDupes（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/elimdupesv2/elimdupes.html）。
如图所示和按下“提交”（图选择参数URE 7 A）。
查看或下载“附加了等级和计数（_count）的唯一序列”（图8B）。
该文件将显示序列变体，以及添加到序列名称的等级和计数。可以使用AliView程序或文本编辑器打开文件（图7 C）。
注意：与SequenceTracer相对，具有歧义序列和缺失序列的变体将在结果中排名，并且需要手动分离。

Figu重新7 。小号使用层序分层ElimDupes

位置核苷酸数值汇总（PNNS）
由于序列变化适中，因此在原始出版物中未分析每个核苷酸位置的碱基组成。可以使用位置核苷酸数值摘要（PNNS）计算器（http://entropy.szu.cz:8080/EntropyCalcWeb/pnns）对高度可变的区域执行此操作。

数据分析

首先，去除具有歧义核苷酸（第1组），短序列（第2组）和缺失序列（排除）的序列，并通过从序列总数中减去这3个组来计算“信息性”序列的数量。SequenceTracer自动执行此计算，而如果使用ElimDupes，则需要手动执行计算。然后，将信息丰富的组划分为每个引物和探针具有最佳匹配的匹配结果和具有不匹配的匹配结果。为了最大程度地减少数据中的低普遍性变异和测序误差对分析的影响，我们在原始出版物（Khan和Cheung，2020年）中将阈值定义为0.5％，其中仅进一步考虑发生率≥0.5％的序列变异。随着更多高质量的病毒序列变得可用，可以定义更严格的阈值（例如0.1％）。定义阈值的另一种方法是包括分析中所有在不同测序实验中发生一次以上的突变（Osorio和Correia-Neves，2020）。然后，根据每个引物和探针的定义阈值以上的序列，计算出具有完全匹配和不匹配的序列的数目和频率。作为一个例子，的CN-CDC-N的分析正向引物5 ' - GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT- 3 ' （WHO，2020）被示出在Ť能够1.分析27所先前公布的PCR测定的本发明内容中给出Ť能够2我们以前的出版物（汗和张，2020）。
错配也可以分为3 '端（最后5个核苷酸）和5 '端的错配。已知PCR扩增在引物的3 '末端更倾向于错配（Whiley和Sloots，2005； Stadhouders等，2010； Lefever等，2013）。而且，探针中的错配可能对PCR扩增具有有害作用。由于防止了探针结合和子序列荧光，即使是单个错配也可能降低测定的灵敏度并导致假阴性结果（Chow等，2011； Brault等，2012）。

表1 。CN-CDC-N正向引物分析

序列数（频率）
序列总数
17027
删除的序列（outgroup1 + outgroup2 +排除）
170
信息序列
16857
完美匹配的序列
13533
序列不匹配
3324
序列超出阈值（0.5％）
总
16662
完美搭配
13533（81.22％）
不匹配
3129（18.78％）
序列超过阈值（0.1％）
总
16817
完美搭配
13533（80.47％）
不匹配
3284（19.53％）
出现次数超过1的序列
总
16852
完美搭配
13533（80.31％）
不匹配
3319（19.69％）

致谢

该协议是我们以前的出版物中使用的方法的详细版本（Khan和Cheung，2020年）。我们非常感谢GISAID EpiCoV TM数据库序列的作者，实验室的发起者和提交者，这些序列是我们研究的基础。该列表包含在电子补充材料中，即我们原始出版物的文件1。这项研究的资金由授予PC的加拿大卫生研究院运营补助金（编号RN227427 – 324983）提供。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考文献
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