材料和试剂
活性细胞周期蛋白B-CDK1纯化了先前描述的蛋白（Okumura等，1996; Watanabe等，2019）
如先前所述纯化的重组鸡MBP（麦芽糖结合蛋白）-CENP-C（aa 601-864）（Watanabe et al 。，2019）
Xpress Micro Dialyzer MD 100（Scienova ，目录号：40075）
Protein Lobind Tube 500 µl （Eppendorf，目录号：0030108116）
Super Sep TM Ace，5-20％，17 - well（FUJIFILM Wako，目录号：194-15021）
CBB染色一号（Nacalai Tesque ，目录号：04543-51）
cOmplete TM不含EDTA的蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：11873580001））
PHOS -tag丙烯酰胺（FUJIFILM光，目录号：300-93523）（木下等人，2006）
三（的Trizma ®碱）（Sigma-Aldrich公司，目录号：T1503-1KG）
MgCl 2 （Nacalai Tesque ，目录号：20909-55）
NaCl （Nacalai Tesque ，目录号：31320-05）
EDTA （乙二胺四乙酸，Nacalai Tesque ，目录号15111-45）
HCl （Nacalai Tesque ，目录号：18321-05）
NaOH （Nacalai Tesque ，目录号：31511-05）
30（w / v）％丙烯酰胺/双混合溶液（29：1）（Nacalai Tesque ，目录号：06141-35）
ATP （三磷酸腺苷）（Nacalai Tesque ，目录号：01072-11）
SDS （十二烷基硫酸钠）（Nacalai Tesque ，目录号：02873-75）
APS （过二硫酸铵）（Nacalai Tesque ，目录号：02627-34）
TEMED （N，N，N' ，N'-四甲基乙二胺）（Nacalai Tesque ，目录号：33401-72）
MnCl 2 （FUJIFILM Wako ，目录号133-00725）
甘油（Nacalai Tesque ，目录号：17018-83）
2-巯基乙醇（SIGMA，目录号：M3148-100ML）
溴酚蓝（FUJIFILM Wako ，目录号101101 ）
甘氨酸（Nacalai Tesque ，目录号：17109-35）
Precision Plus蛋白质双色标准液（Bio-Rad，目录号：161-0374）
1 x激酶缓冲液（KB）（请参阅食谱）
2 x激酶缓冲液（请参阅食谱）
25 x cOmplete TM不含EDTA的蛋白酶抑制剂（请参阅食谱）
磷酸标记5（w / v）％丙烯酰胺/双（29：1）凝胶（请参见食谱）
分离胶
堆积胶
SDS-PAGE运行缓冲区（请参阅食谱）
2个Laemmli样本缓冲液（请参阅食谱）
1 x Laemmli样品缓冲液（请参阅食谱）

设备
1. Ñ ANO d ROP 2000C光谱仪（赛默飞世尔科技，米Odel等：纳米滴TM 2000C分光光度计，目录号：ND2000C）
2. SDS-PAGE凝胶电泳室（生物工艺，目录号：BE-230G）
3.扫描仪（EPSON，型号：GT-X980）
4. Invitroshaker （TAITEC，米Odel等：摇-LR，目录号：0054809-000）

软件
Imag eJ 1.8.0_172（A Bramoff等，2004）

程序

MBP-CENP-C的制备（aa 601-864）
注意：尽管我们描述了使用CDK1进行MBP-CENP-C（aa 601-864）磷酸化的方案，但该方案可应用于您所感兴趣的其他激酶及其底物。

如Watanabe等人所述纯化重组MBP-CENP-C（aa 601-864）。（2019）。
注意：简而言之，MBP-CENP-C（aa601-864）在细菌中表达，并用直链淀粉树脂和具有Superdex 200 pg的Hi-Trap SP柱进行纯化。将纯化的蛋白质用含20 mM HEPES-NaOH （pH 7.5 ），500 mM NaCl，5％甘油，1 mM EDTA-NaOH （pH 8.0 ）和1 mM DTT的缓冲液溶解。纯化的蛋白质在液氮中速冻并保存在-80 ℃。冷冻的蛋白质应在使用前在冰上解冻。
准备1,000 ml冰冷的1 x激酶缓冲液（在配方中加了l ）。
按照产品说明手册，将MBP-CENP-C（aa 601-864）注入Xpress Micro Dialyzer中至多100 µl，然后在1,000 ml 1x激酶缓冲液中于4°C透析该蛋白过夜。
注意：透析对于从蛋白质样品中去除EDTA以及调整下一步的盐浓度非常重要。因为高浓度的盐和EDTA会抑制激酶反应并干扰在Phos -tag SDS-PAGE上运行的磷蛋白。

Ç ollect透析MBP-CENP-C（AA 60 1-864）成蛋白质的Lobind在冰上管。
使用分子吸收率和分子量与分析蛋白质浓度Ñ ANO d ROP 2000C谱仪（德贾斯丁等人，2009）。
注意：由于在下一步骤中，衬底是附加编为在2毫克/毫升（最终浓度）的激酶反应，如果蛋白质的浓度小于2毫克/毫升，使用浓缩物的蛋白质的Amicon超。

激酶反应的优化
注意：要在激酶反应中获得最佳磷酸化，可以优化几个条件：底物浓度，激酶量，反应缓冲液以及反应时间和温度。在这里，我们演示了激酶测定中反应时间优化的示例。

混合透析MBP-CENP-C （AA 601-864）的激酶缓冲液用100mM ATP，25 X完整TM无EDTA蛋白酶抑制剂（升在食谱isted ），活性细胞周期蛋白B-CDK1（相对H1激酶活性：1.4 pmol P / min µl），并添加2 x激酶缓冲液（在配方中以l表示）和H 2 O以将每种成分的浓度调节至1x激酶缓冲液中的最终浓度，如表1所示，其显示了我们具有代表性的10 µl规模的反应混合物。
笔记：

您可以根据实验设计更改激酶反应的量。
建议量取少量等分试样，并在-20°C下存储100 mM ATP，以避免多次冻融循环。
活性细胞周期蛋白B-CDK1的纯化已在Okumura等人的文章中进行了描述。（1996 ）。

表1. R代表激酶反应混合物
孵育10微升反应混合物TURE在25 ℃。轻轻中号IX与轻敲样品每15分钟。
注意：在该方案中，为了检查最佳反应时间，将几个10 µl规模的反应液温育在图1中指定的时间段（0、30、60和90分钟）。

为了终止反应，添加10微升的2 X的Laemmli样品缓冲液（升在食谱isted）添加到反应混合物TURE 。然后，再添加20 µl 1 x Laemmli样品缓冲液，以在下一步中调整用于SDS-PAGE的蛋白质浓度（在食谱中以L表示），并在96 °C下加热样品5分钟。
注意：如果您将磷酸化蛋白用于其他体外测定（例如下拉测定），请通过向反应混合物中添加终浓度为5 mM的1 M EDTA-NaOH （pH 8.0 ）来停止激酶反应。

使用Phos -tag SDS-PAGE检测磷酸化底物
制备PHOS -tag 5 （W / V）％ -丙烯酰胺/ Bis（29：1）凝胶（25个μM PHOS -tag，升在食谱isted ）。
注意：为了在Phos -tag SDS-PAGE中获得磷酸化蛋白的最佳分离，应该优化Phos - tag和丙烯酰胺的浓度。组装成凝胶电泳室（升在设备isted ）。

甲DD SDS-PAGE电泳缓冲液电泳室（升在食谱isted ）。
在每个泳道中，将0.5 µg磷酸化蛋白上样至1 x Laemmli样品缓冲液中，并将5 µl分子量标记物加到凝胶上。
注意：如果您的分子量标记包括盐和/或EDTA，则它们会干扰样品在Phos -tag SDS-PAGE上的下一泳道中运行。为避免此问题，应在分子量标记和下一个样品之间插入一条空泳道。

使用35 mA恒定电流运行凝胶55分钟。
电泳后，使用Invitroshaker （速度60）用水洗涤凝胶5分钟。
除去水，并用50 ml的CBB Stain One填充凝胶。将带有CBB染料的凝胶在700 W微波炉中加热1分钟（约70 °C ）。
使用Invitroshaker （速度60）在室温下摇动凝胶10分钟。
去除CBB污渍1，然后使用Invitroshaker （速度60）用水将凝胶洗涤1分钟两次。
用50毫升新水填充凝胶。用水在700 W微波炉中将凝胶加热1分钟（约70 °C ）。
使用Invitroshaker （速度60）在室温下用温水摇动凝胶60分钟以上。
除去水并用水洗涤凝胶两次，并使用图像扫描仪获取染色的凝胶的图像。

使用常规SDS-PAGE检测磷酸化底物
注意：要检查蛋白质水平和底物质量，请使用常规的SDS-PAGE，因为很难精确比较蛋白质水平并在Phos -tag SDS-PAGE上检测少量蛋白质片段。此过程是可选的，但我们强烈建议您这样做，因为某些蛋白可能会在激酶反应过程中降解。

准备超级九月TM王牌，5-20％，17 -以及SDS预制凝胶。
组装成凝胶电泳室（升在设备isted ）。
甲DD SDS-PAGE电泳缓冲液电泳室（升在食谱isted ）。
在每个泳道中，将0.5 µg磷酸化蛋白上样至1 x Laemmli样品缓冲液中，并将5 µl分子量标记物加到凝胶上。
使用35 mA恒定电流运行凝胶55分钟。
电泳后，用水洗涤凝胶5分钟。
除去水，并用50 ml的CBB Stain One填充凝胶。将带有CBB染料的凝胶在700 W微波炉中加热1分钟（约70 °C ）。
使用Invitroshaker （速度60）在室温下摇动凝胶10分钟。
去除CBB污渍1，然后使用Invitroshaker （速度60）用水将凝胶洗涤1分钟两次。
用50毫升新水填充凝胶。用水在700 W微波炉中将凝胶加热1分钟（约70 °C ）。
使用Invitroshaker （速度60）在室温下用温水摇动凝胶60分钟以上。
除去水并用水冲洗凝胶两次，然后使用图像扫描仪获取染色的凝胶图像。

数据分析

在Phos -tag SDS-PAGE中，如果与未处理的样品蛋白条带相比，在激酶处理的样品中蛋白条带上移，则表明底物在体外被激酶磷酸化。Phos -tag SDS-PAGE中的带移取决于磷酸化残基的数量及其在底物中的位置。

图1显示的代表性图像p hosphor上-蛋白分析PHOS使用本章中描述的方案-tag（左）和常规（右）SDS-PAGE凝胶。用CDK1处理的MBP-CENP-C（aa 601-864）清楚地显示了Phos - tag SDS-PAGE的迁移率变化，表明CDK1使CENP-C磷酸化。重要的是，PHOS -tag SDS-PAGE使检测的移动性的变化p hosphor -proteins，不改变在常规SDS-PAGE其流动性。底物的磷酸化水平可以通过使用ImageJ开放式软件（Abramoff et al 。，2004）对位移带的强度进行定量来评估。

CDK1处理后30分钟，MBP-CENP-C（aa 601-864）显示出明显的移位带，未磷酸化蛋白带水平降低（图1，左）。随后，在随后的时间点，MBP-CEN PC（aa 601-864）表现出进一步的迁移率变化，表明MBP-CENP-C（aa 601-864）在两个位点被CDK1磷酸化，但CDK1似乎具有不同两个位点之间的磷酸化效率。

总之，本体外ķ使用inase测定方案PHOS -tag SDS-PAGE是一个简单但用于检测激酶活性，并分析蛋白质磷酸化有用的方法。

图1.在Phos -tag和常规SDS-PAGE上分析CDK1介导的CENP-C磷酸化。一。左图显示了MBP（麦芽糖结合蛋白）-CENP-C（氨基酸601-864）的Phos标签SDS-PAGE分析：MBP-CENP-C 601-864用CDK1处理了指定的时间。右图显示了相同样品的常规SDS-PAGE分析。M显示分子量标记。在左侧的Phos - tag SDS-PAGE分析中，MBP-CENP-C 601-864被上移，表明CEK -C在体外被CDK1磷酸化。乙。该图像显示了MBP-CENP-C 601-864和MBP的Phos - tag SDS-PAGE分析，它们用CDK1处理了指定的时间。不是CDK1底物的MBP没有显示迁移率变化，表明磷酸化蛋白可以在Phos -tag SDS-PAGE上特异性检测。

菜谱
1 x激酶缓冲液（KB）
10 mM的Tris-HCl ，pH 7.5
2毫米氯化镁2
150毫米氯化钠
2 x激酶缓冲液
20 m M Tris-HCl ，pH 7.5
4毫米MgCl 2
300毫米氯化钠
25 x cOmplete TM不含EDTA的蛋白酶抑制剂
含2毫升水的1片不含cOmplete TM EDTA的蛋白酶抑制剂
Phos- tag 5（w / v）％丙烯酰胺/双（29：1）凝胶
分离胶
5 （w / v）％丙烯酰胺/双混合溶液（29：1）
375 mM的Tris-HCl ，pH 8.8
0.1％SDS
0.1％APS
0.1％TEMED
25μM PHOS -标签丙烯酰胺
50 µM的MnCl 2
注意：建议制作少量等分试样，并在-20 °C下存储100 µM MnCl 2 ，以避免多次冻融循环。使用旧的MnCl 2储备液会导致Phos -tag SDS-PAGE上磷酸蛋白迁移率的无效改变。

堆积胶
3.5 （w / v）％丙烯酰胺/双混合溶液（29：1）
120 mM的Tris-HCl ，pH 6.8
0.1％SDS
0.2％APS
0.2％TEMED
SDS-PAGE运行缓冲区
25 mM Tris
192 mM甘氨酸
0.1％SDS
2x Laemmli样品缓冲液
0.125 M Tris-HCl ，pH 6.8
20％甘油
SDS 4％
10％2-巯基乙醇
0.005％溴酚蓝
1 x Laemmli样品缓冲液
0.0625 M Tris-HCl ，pH 6.8
10％甘油
2％SDS
5％2-巯基乙醇
0.0025％溴酚蓝

致谢

这项工作得到了TF的JSPS KAKENHI资助号17H06167、16H06279和15H05972，MH的JSPS KAKENHI资助号16K18491和MA的JSPS KAKENHI资助号18K06084的支持。该协议改编自Watanabe等人并在其中使用。（2019）。

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

参考文献
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