材料和试剂

大脑中动脉闭塞

1.迷你血管夹（Aesculap Surgical Instruments，目录号：FD562R）
2.硅橡胶涂层单丝（Doccol，目录号：702056PK5Re）
3.真丝缝合线尺寸7-0，每卷100码（Teleflex，货号：103-S）
4.针号为3-0的真丝缝合线（Covidien，Sofsilk，目录号：SS694）
5.手术胶带（3M Transpore，3M ID 70200739582）
6. Softasept N（布劳恩，目录号：3887138）
7.棉垫和棉签

急性海马切片电生理

培养皿
50 ml猎鹰管（例如，猎鹰，目录号10788561）
15 ml猎鹰管（例如，猎鹰，目录号10773501 ）
剃须刀片（例如，吉列银蓝色）
气石（Robu Glasfilter，货号18105）
滤纸（Sartorius，目录号：FT-3-303-055）
强力胶（例如，UHU，目录号：36016 ）
注射器过滤器，0.22 µm（运动，目录号：ESF-MC-13-022）
厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管（科学产品，目录号：GB150F-8P）

试剂种类

NaCl（卡尔·罗斯，目录号：9265.1）
KCl（卡尔·罗斯，目录号：6781.1）
CaCl 2 （Carl Roth，目录号：A119.1）
MgCl 2 （卡尔·罗斯，目录号：2189.1）
MgSO 4 （Carl Roth，目录号：0261.1）
NaHCO 3 （卡尔·罗斯，目录号：HN01.2）
NaH 2 PO 4 （卡尔·罗斯，目录号：T879.2）
葡萄糖（Carl Roth，目录号：HN06.3）
蔗糖（卡尔·罗斯，目录号：9286.2）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
葡萄糖酸K（Carl Roth，目录号：2621.2）
MgATP（Sigma-Aldrich，目录号：A9187）
NaGTP（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
HEPES（卡尔·罗斯，目录号：HN77.2）
KOH（卡尔·罗斯，目录号：K017.1）
生物素（Tocris，目录号：3349）
链霉亲和素-Cy3 （Sigma-Aldrich，目录号：S6402-1ML）
TBS（Thermo Fisher，目录号：28358）
普通驴血清（Abcam，货号：ab7475）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
4％PFA（Sigma-Aldrich，目录号：1004965000）
荧光灯（Sigma-Aldrich，目录号：F4680）
切片解决方案（最终）（请参阅食谱）
人工脑脊液（最终）（请参阅食谱）
切片溶液10 x库存（请参阅食谱）
脑脊液10 X库存，500米升（见配方）
2 M葡萄糖原液（请参阅食谱）
1 M CaCl 2储备溶液（请参阅配方）
1 M MgCl 2储备溶液（请参阅配方）
切片解决方案（请参阅食谱）
aCSF（请参阅食谱）
细胞内溶液（请参阅食谱）
TBS Plus（请参阅食谱）

设备

大脑中动脉闭塞

持针器（精细科学工具，目录号：12010-14）
钝性手术剪刀（精细科学工具，目录号：14003-14）
标准钳（精细科学工具，目录号：11000-13）
弯曲标准镊子（精细科学工具，目录号：11001-12）
哈特曼止血钳（精细科学工具，目录号：13002-10）
精致的缝合线钳（精细科学工具，目录号：11063-07）
弹簧剪刀（精细科学工具，目录号：15018-10）
温度控制器（FHC，目录号：40-90-8D）
加热垫（FHC，目录号：40-90-2-02）
迷你直肠热敏电阻探头（FHC，目录号：40-90-5D-02）
带冷光源的体视显微镜（Zeiss，Stemi 508，目录号：495009-0016-000）

急性海马切片电生理

200毫升烧杯
实验室计时器
弯曲钝钝手术剪刀（精细科学工具，目录号：14003-14）
小剪刀（精细科学工具，目录号：14184-09）
阿德森钳（精细科学工具，目录号：11006-12）
小弯钳（精细科学工具，目录号：11152-10）
锅铲（精细科学工具，目录号：10099-15）
微型装载器微毛细管（Eppendorf，目录号：5242956003）
振动刀片切片机（Leica VT1200 S，目录号：1491200S001）
水浴（GFL水浴，货号：1108）
渗透压计（Gonotec Osmomat 010）
蠕动泵（Ismatec ISM830，目录号：GZ-78016-02）
立式电生理显微镜（Zeiss Axio Examiner.Z1）
膜片钳放大器（分子d evices，目录号：的Axopatch200B-2）
数字转换器（分子d evices，目录号：Digidata 1550B4）
微量移液器拔出器（Sutter I仪器，P-97火焰状/棕色，目录号：P-97）
恒流刺激单元（Digitimer Ltd.，DS3 ）
（可选）商业堰板腔（科学P RODUCTS，脑片Keeper1，目录号：BSK1）

软件

ZE N 2.3（蓝色版）成像软件（德国蔡司）
pCLAMP 10.7（分子设备，Axon仪器）

程序

短暂性脑中动脉阻塞
准备的必要仪器开始之前的实验中（图1）。

图1. MCAO程序的必要工具

称重小鼠，并在开始手术前30-60分钟口服一滴美洛昔康（0.5 mg / ml ，对于25 g小鼠约25 µg）进行止痛治疗。
将鼠标放在麻醉盒中，并打开3：1 N 2 O：O 2中的2.5％异氟烷混合气体，等待鼠标入睡。捏住尾巴或脚掌，测试疼痛反应。
将鼠标仰卧在加热板上。用外科手术胶带固定脚掌，引入微型直肠热敏电阻探头，并在异氟烷/氧气/一氧化二氮的连续通量下，在手术台上将体温保持在37°C。
注意：小鼠MCAO模型中较低的体温将导致较小的梗塞面积，更一般而言，MCAO协议期间的体温变化将导致更大的梗塞面积变异性和神经功能缺损严重性。小鼠的年龄也与结果有关（Sieber等，2010）。

用Softasept N消毒腹侧颈区并做中线切口。用标准镊子和弯曲标准镊子通过轻轻推向侧面的脂肪组织，肌肉和甲状腺来暴露颈总动脉。使用立体显微镜下的细镊子解剖颈总动脉，分叉以及颈内动脉和颈外动脉。
分叉后，在近端颈外动脉周围用丝线缝合，在靠近分叉的颈总动脉周围用另一根缝合线。使用微型血管夹，将颈内动脉向近端夹紧，从而在颈总动脉中引起轻微的血管充血，有助于下一步。
在靠近缝合线的颈总动脉上做一个小切口，打开小血管夹并插入单丝以阻塞大脑中动脉，直到无法进一步发展到轻压（插入长度约10 mm）为止。围绕颈内动脉用缝线将单丝固定在适当位置，应仅用一个结点将其固定。闭合伤口。
注意：写下单丝的插入深度，以控制其在缺血期间不移动，并作为跨小鼠的对照。

在加热灯下让动物从麻醉中恢复。缺血时间通常为45分钟，但可能会在30到45分钟之间变化，具体取决于梗塞的预期大小。随着时间间隔的延长，梗塞也会累及皮质。
注意：缺血时间需要权衡：持续时间短可能会导致许多动物的梗塞变得不够大，而缺血时间长会增加死亡率，因此需要更大的实验组。合格且训练有素的人员对于减少变异性至关重要。

在缺血时间结束前5分钟重新麻醉动物。松开单丝上的缝合线，然后取下单丝。缝合颈总动脉，检查是否出血并闭合伤口。从麻醉中恢复过程中观察动物，并将其放回笼中。
对于来自对照组的小鼠小号TEP阿7被跳过。
术后三小时和术后每天根据预先建立的评分表对小鼠进行对照和评分。
注意：应每天检查体重一次或两次，并采取早期干预措施，例如为行动不便的小鼠在笼地板上提供湿食物和烧杯水，可以帮助降低死亡率。评分还可以使临床卒中严重程度与单细胞电生理特性相关联。

急性海马片
在开始之前：
如图2所示，将较小的塑料P etri盘粘贴到较大的玻璃盘中，从而组装解剖盘。可选地，小的底部P ETRI盘可以在一硅橡胶毫米的覆盖解剖期间提供防滑表面。

图2.准备急性海马切片的必要仪器

组装的脑切片室：Ç UT一个的顶部部分50米升Falcon管并切出管的盖，以便只有外筒遗迹。在切口盖和猎鹰管的顶部之间放一个棉网或尼龙网，并将其拧紧到位。使用15毫升l猎鹰管，将其底部切开，并用一个小的塑料称重盘将所有元件固定在适当的位置，如图2所示（下排，最右边）。或者，如果有相关的研究车间，则可以准备或以商业方式购买由丙烯酸玻璃制成的更稳定的结构。
准备500 ml的基于蔗糖的切片溶液，并填充200 ml的烧杯的一半，玻璃纤维刀缓冲托盘的底部（未覆盖样品台）和解剖盘的外环，然后将其放入冰箱在-20°C过夜。
在实验的第一天，制备500米升基于蔗糖的新鲜切片溶液和千米升aCSF中。用aCSF填充脑切片腔室，并将其放入33°C的水浴中，同时鼓泡Carbogen（5％CO 2 /95％O 2 ）。填补了200米升烧杯，并用切片溶液解剖托盘的内圈的底部。将剩下的切片溶液放在不断冒泡的冰上。
注意：在开始实验之前，也可以将手术器械放在冰上进行冷却。
按照说明手册准备振动刀：将剃须刀刀片放入其支架中，然后使用Vibrocheck对准刀片。
用异氟烷麻醉鼠标，启动计时器并用手术剪刀将麻醉的小鼠断头。立即放置在头在200 m的冰冷溶液切片升烧杯中。
注意：移开大脑是关键步骤，必须在一分钟内完成。在这些关键步骤中保持时间的直观记录，然后将其填写在实验手册中，以说明切片或测量质量可能存在的变化。记录当天应避免疏忽大意，因为β-肾上腺素受体的激活可能导致GluA3 AMPA受体的增强和数据的变异性（Renner et al。，2017）。

我们Ë小剪刀来剪从枕骨大孔枕骨往两边的耳道，然后由内侧枕骨大孔切向拉姆达。在步骤之间将颅骨保存在冰冷的切片溶液中。
我们Ë的斜角肌挤压钳子到由内侧扑它侧向地取出枕骨，然后沿矢状缝类似地移除顶骨，露出大脑。在步骤之间将颅骨置于冰冷切片溶液中。
将刮刀沿着锁骨插入，切断颅神经，然后将大脑移入解剖盘中。
我们è刀片使在上丘水平的冠状切口，并分离去除小脑。用矢状矢状切开术将两个半球分开，并将半球与中风同侧（右）放在内侧。接下来，沿顶叶皮质（图3A）并垂直于矢状平面（图3B）进行纵向切割，并通过在冠状平面内切开来分离额叶（图3C）。
注意：这是至关重要的步骤，因为切片的平面将在最大程度上决定细胞生存力，从而决定切片质量。目的是获得平行于顶端树突状树的平面并垂直于海马长轴的横切面。但是，由于海马的复杂三维结构（类似于海马或香蕉），没有一个平面对于海马的整个长度都是最佳的。上述坐标将得到可行的切片从中间向腹侧海马（图3a，3 b [ LEIN等人。，2007 ] ）。根据切片的厚度，可以从一个海马体中获得大约三个高质量的切片。对于海马的其他子区域，选择不同的切片角度（Bischofberger等，2006）。我们建议在项目开始时留出大量时间和（动物）资源，以寻找和完善切片角度，从而实现最佳切片可行性。去除的额叶可用于估计局部缺血的大小（例如通过Map2染色），因为受影响的区域通常包括额顶皮层和外侧颅缘。

图3.准备急性海马体切片的大脑方向和切面。一。大号ateral视图。乙。Ç ranial视图。Ç 。d orsal视图。红色阴影区域表示海马区域，其中在当前方向上的切片质量可能次优，而绿色阴影区域表示具有最佳细胞生存力的切片。©2015艾伦脑科学研究所。Allen Brain Atlas API。可从以下网站获得：brain-map.org/api/index.html 。

将两滴氰基丙烯酸酯胶滴在缓冲托盘的干燥台上。在小弯钳的帮助下，将海马背侧朝下放在刮刀上，用滤纸吸收多余的液体，然后小心地将海马背侧朝下放入氰基丙烯酸酯胶中。大脑应以其侧面朝向刀片的方式胶合（图3C）。将冰冷的切片倒入溶液中，以完全覆盖缓冲液托盘中的海马体。
用0.05mm / s的速度和1.2mm的水平振荡幅度制作300 µm的切片（Geiger等，2002）。将切片转移到33°C水浴中的脑切片腔中，并在持续不断的气泡鼓泡下孵育45分钟。
从水浴中取出脑切片室，让切片在室温下恢复另外60分钟。
注意：恢复的温度和时间会影响脑片的代谢和电生理特性，应仔细监测并保持恒定（zur Nedden等，2011）。

成体颗粒细胞和生物细胞素染色的全细胞记录的电生理学考虑
获得全电池配置所需的仪器和步骤的详细描述超出了本段的范围，并且已经有大量可用的资源（Walz，2007； Sakmann，2009； Okada，2012； Graziane和Dong，2015）。下面介绍了与从成年传播的颗粒细胞进行全细胞分析有关的技术特点。
对于来自老年小鼠的急性海马切片（3-6个月以上），可以采用切片溶液的改良配方以提高切片质量和细胞生存力（Ting等人，2011和2014）。
非常高的输入阻抗（1 - 10GΩ）和低电容（5 - 10 pF）时，由于非常小的尺寸构成为电生理学家技术困难。贴片移液器应由厚壁玻璃制成，并应小心补偿移液器的电容。密封电阻应至少为输入电阻的3倍（最好> 5倍）。
了解密封形成过程中的膜动力学和稳定性可以帮助选择已形成稳定密封的细胞，并丢弃具有千兆肽但密封结构不良的细胞，最终节省时间（Suchyna等，2009）。图4A和图4B分别显示了有前途的印章以及成功进行定性记录的可能性低的印章的变化。

图4.葡萄糖形成过程中细胞膜的状态可以告知良好记录的可能性。A. P romising方面包括一个凸起的，直的，或稍微凹密封膜具有相对均匀的荧光信号（在移液管尖端的稍暗）。B.小号eals不可能赋予稳定的记录显示用INH更凹补丁膜omogeneous荧光信号，倾斜的贴片膜（线加入供参考），和更不均匀的膜片指示膜起泡（箭头）的。

一组神经元（例如齿状颗粒细胞）的电生理特性在多个空间维度上表现出异质性（Cembrowski和Spruston，2019），因此在特定的海马区（例如腹侧或背侧海马）上定居可能有助于减少变异性。
液体结电势应在实验前进行测量和补偿（Barry and Lynch，1991）。
由于不成熟的成年颗粒细胞非常高的输入电阻，因此相对较小的电流注入可能足以破坏膜的稳定性并损害细胞。5的递增步骤- 10pA的最初应执行，因为中值rheobase约为30 PA未成熟粒细胞（Ceanga等人，2019）。协议开始时的静止电位至关重要，因为在去极化电位下，Na +通道处于非活动状态。一些神经元从静止膜电位开始去极化（I hold = 0 pA）时仅产生小穗/未成熟动作电位，而从更负电位开始（I hold = -20 pA）去极化时可能会产生较高的动作电位。
记录的细胞的生物细胞素染色由于未成熟的成年颗粒细胞在小组织中的不稳定锚定而变得复杂，这是因为体细胞小且树突状树发育不足（图5），这通常导致用移液管去除细胞（细胞残留粘到移液器吸头上）。从神经元中非常缓慢地移出移液管可以帮助增加保留在切片中的修补细胞的百分比。高质量的重建通常需要至少10分钟来填充神经元。

图5.在不同成熟阶段生物素填充后，成人传播的颗粒细胞的共聚焦图像。神经元显示树突树的发育从左侧的未成熟到右侧的成熟表型（3.5个月大的小鼠）。栏= 50 μ米。

记录后，将切片转移到4％PFA中（例如，在4孔板中，一个切片/孔），并在4°C下储存过夜（不过，切片也可以在4％PFA中处理4小时）。
接下来，将切片在TBS中轻轻洗涤4×15分钟，然后在TBS Plus中孵育2小时。然后添加1：500链霉亲和素-Cy3，并在4°C下孵育过夜。
第二天，将切片在TBS中清洗4×15分钟，并将切片嵌入Fluoromount中。
注意：切片的方向必须在孔板盖上注明（例如，齿状回的尖端指向左侧或右侧）。由于切片的厚度为300 µm，因此应将最靠近记录细胞的切割面朝上放置，否则扫描细胞时来自组织的散射和自发荧光会影响图像质量。记录的细胞通常在表面附近，约5 0 µm深的切片应轻拿轻放地转移。嵌入切片时，仅将其轻轻按压在盖玻片上，以免损坏已记录细胞的形态。

菜谱

切片解决方案（最终）
浓度（以毫米为单位）：

87氯化钠

25碳酸氢钠3

2.5氯化钾

1.25 NaH 2 PO 4

7氯化镁2

25葡萄糖

75蔗糖

1.3抗坏血酸

0.5氯化钙2

人工脑脊液（最终）
浓度（毫米）

氯化钠126

26碳酸氢钠3

3氯化钾

1.25 NaH 2 PO 4

1硫酸镁4

2氯化钙2

10葡萄糖

1.3抗坏血酸

切片溶液10 x库存
870毫米氯化钠

25毫米氯化钾

250毫米NaHCO 3

12.5毫的NaH 2 PO 4 ，制备500米升了一个星期，储存在4℃下

aCSF 10 x存货，5亿升
1 ，260毫氯化钠

30氯化钾

260碳酸氢钠3

12.5 NaH 2 PO 4

制备500米升了一个星期，储存在4℃下

2 M葡萄糖原液
72.064克为200米升H中原液2 ö

1 M CaCl 2储备溶液
22.198克为200米升H中原液2 ö

1 M MgCl 2储备溶液
对于在H 2 O中的200 m l储备溶液为40.660 g

切片解决方案
10 x库存切片溶液（100 m l存货，最终1 L）

库存中有7 mM MgCl 2 （最终1 L时有7 m L库存）

库存中的葡萄糖为25 mM（1 L时为12.5 m l ）

75 mM蔗糖

1.3 mM抗坏血酸钠

储备液中的0.5 mM CaCl 2 （最终1 L的储备液为250 µl ）。最后，缓慢加入以防止CaCO 3沉淀，并与碳黑平衡，并保持在4 °C。pH值应稳定在7.4，渗透压为340-350 mOsm。

脑脊液
10 x库存切片溶液（100 m l存货，最终1 L）

1毫米MgSO 4

库存中的葡萄糖为10 mM（1升时为500万升）

1.3 mM抗坏血酸钠

2毫米氯化钙2从库存（1米升1 L终股票）。最后缓慢加入以防止CaCO 3沉淀，并用Carbogen平衡。pH应稳定在约7.4，渗透压为300-310mOsm。

细胞内溶液
140 mM葡萄糖酸

10毫米氯化钠

2毫米MgATP

0.3毫米NaGTP

0.6毫米EGTA

10 mM HEPES，pH 7.2（含KOH），渗透压285 mosm / kg

在量筒中在冰上制备50-100 ml的细胞内溶液，在1 ml的试管中过滤并分装，并在-20°C下保存长达六个月
在实验当天，添加4 mg / ml生物素并离心管
超声波浴可以帮助生物素更快地溶解
剧烈涡旋后，将细胞内的溶液可以以1μm的被抽吸升注射器，它是音响升吨ER编用0.22μm过滤器和微加载微毛细管。记录过程中，带有细胞内溶液的注射器应放在冰上
TBS加
TBS

5％驴血清

0.3％海卫一X -100

致谢

这项工作得到了耶拿跨学科临床研究中心（IZKF）的支持。这些协议用于本文（Ceanga等人，2019）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

伦理

所有实验程序均符合欧盟指令2010/63 / EU，并获得德国动物护理和使用委员会的批准。

参考文献

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