材料和试剂
微量移液器的无菌吸头（STARLAB，目录号：S1122-1830 [1,000 µl]，S1120-3810 [10-20 µl] ）
1.5 ml和2 ml无菌离心管（SORENSON，目录号：017040A; TREFF，目录号：96.09329.9.01）
无菌塑料培养皿（直径90毫米，Clearline，货号：076084BS）
0.22 µm孔过滤器（PVDF 33毫米，ClearLine，Dutscher，目录号：051733）
供体和受体细胞，用于携带抗生素选择不同的选择标记＃
＃注意：无乳链球菌菌株*标记有先前通过使用pMT85衍生的质粒进行转座而引入的选择标记（图1）（Zimmerman和Herrmann，2005）。pMT85及其衍生物带有一个mini-Tn，具有aacA-aphD庆大霉素抗性盒，对四环素抗性的tetM决定子或赋予嘌呤霉素抗性的pac基因。标记基因的两侧是两个Tn4001反向重复序列（IR）。由于mini-Tn骨架不包含转座酶基因（其位于pMT85中的其他位置），因此其插入细胞染色体中是稳定的（Baranowski等人，2010）。

几种无乳支原体菌株（例如5632，PG2、4867、14628和4055）已成功用于交配测定（Dordet-Frisoni等人，2019），但结合反刍支原体的其他物种如M也成功进行了缀合实验。牛vis PG45菌株（Dordet-Frisoni et al。，2014）和M. mycoides subsp。卡普里GM12毒株（个人资料）。为了发生共轭，两个伙伴中至少有一个应携带ICE。“关于染色体转移（MCT），只有两种无乳分枝杆菌菌株被证明是受体细胞，即5632和4867，而迄今为止测试的所有菌株都可以作为供体。至于ICEA，所有带有活性ICE的菌株都可能是供体细胞。上面引用的所有亲本无乳分枝杆菌菌株都可以在Vigimyc馆藏获得（Chazel et al。，2010）。

图1.代表无乳支原体抗生素标记程序的示意图。通过使用带有抗生素抗性基因作为选择标记的微型转座子pMT85进行转座来引入选择标记（Antibiotic R ）。抗生素R标记的侧面是两个反向（IR）Tn4001重复序列。在插入过程中，位于IR外部的转座酶（Tnp）被消除，选择标记以随机（以编码（CDS）或非编码序列）和稳定的方式整合到染色体中。该实验导致在染色体上不同位置标记有抗性标记（ATB R ）的支原体转化体。

适当的可选抗生素：
庆大霉素（Gm R ）（Gibco，目录号：15750037）

四环素（Tet R ）（Sigma-Aldrich，目录号：T3383）

嘌呤霉素（Pur R ）（Fisher，目录号：10054207）

氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）

PPLO汤（Difco，目录号：255420）
胰蛋白p（Difco，目录号：211705）
Bacto蛋白ept（Difco，目录号：211677）
FBS（胎牛血清）（Gibco，目录号：10270-106）
CMRL 1066（10x）（Gibco，目录号：21540-026）
TC酵母酸酯（Difco，目录号：255772）
酵母提取物15％（Gibco，目录号：18180-059）
D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G6152）
酚红0.5％（Sigma-Aldrich，目录号：P0290）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
选择琼脂（Invitrogen，目录号：30391-023）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
D-PBS（Gibco，目录号：14190169）
吐温- 20（Sigma-Aldrich公司，目录号：P9416）
超纯Tris（Invitrogen，货号：15504020）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
蛋白酶K 20 mg / ml（Qiagen目录号：19131）
Taq DNA聚合酶（新英格兰生物实验室目录号：M0267L）
dNTP mix 10 mM（新英格兰生物实验室目录号：N0447S）
Taq Buffer 10x（新英格兰生物实验室目录号：M0267L）
SP4无菌液体培养基（请参阅食谱）
无菌SP4琼脂板（请参见食谱）
无乳分枝杆菌裂解缓冲液（请参阅食谱）

设备

气流柜（更快，型号：SF Classic 212 ）
37°C恒温箱（Firlabo，型号：FA Type B 407L-FA407B ）
带有转子的微量离心机，用于1.5-2 ml试管（Eppendorf，型号：5424）
Vortex（科学工业公司，型号：GENIE 2 ）
双目放大镜（奥林巴斯，型号：SZ 60 ）
多块加热器（Lab Line Instruments，型号：2052-1CCE）
Thermocycler（Mastercycler EP Eppendorf Gradient，型号：5341）
微量移液器（GIilson Pipetman Classic 10μl至1 ml范围，Dutscher，目录号：066002、066003、066004、066005和066006 ）
带刻度的移液器（猎鹰5至25毫升范围的移液器，Dutscher，目录号：357543、357551和357535 ）
移液器（Pipetboy Acu 2，INTEGRA，DUTSCHER，目录号：060201 ）

程序

下面也提供了该过程的示意图（图2）。

文化准备
在无甘油或没有特定存储条件下于-80°C的条件下，向无水链球菌无饱和分枝杆菌的每一种饱和液体生长培养物（约10 9 CFU / ml的标准细菌储备液）中接种10 ml SP4液体培养基1 ml。在室温下。
将培养物在37°C下孵育24小时，不要在培养箱＃中摇动。
＃注意：生长速度取决于无乳链球菌菌株，在SP4培养基中孵育16小时至48小时不等。SP4介质中存在的酚红色从红色变为橙色表示最佳生长。

交配程序
在2 ml无菌微量离心管中混合1 ml ＃每个饱和支原体培养物（在10 8和10 9 CFU / ml之间）。
＃注意：供体：受体支原体细胞的比例应接近1：1。取决于化验或两种支原体培养物的浓度（例如，由于生长速率的差异），该比率可以在同一条件下更改为1：2（体积：体积）或1:10（体积：体积）最终体积为2毫升。

在室温（20-25°C）下以8,000 x g将2 ml混合培养物离心5分钟。
使用1 ml微量移液器小心丢弃上清液。
重悬，在室温下1毫升SP4液体介质的粒料，进行2〜3绘图/二scharging个循环，1种毫升微量。
孵育过夜＃在37℃不振荡。
＃注意：孵育3小时后可以观察到结合事件，但至少16 h后可以观察到最高的交配频率。

电镀
一部分配合混合物（10至50 µl）用于确定总CFU ＃。为此，请在DPBS 1x + 5％失配的FBS中制备系列稀释液（从10 -1到10 -7 ），然后将10 µl每种稀释液点样到不含选择压力的SP4琼脂板上。
＃注意：如果结合效率是通过转导结合体/供体细胞或转导结合体/受体细胞的比例表示的，则将每种稀释液10 µl分别以适当的浓度点样到含有对应于供体/受体菌株的抗生素标记的SP4琼脂平板上。

将300 µl的交配混合物接种到选择性SP4琼脂平板上。通过轻轻的圆周运动将液体撒到培养皿的表面（90毫米）上，以使整个培养皿（边缘除外）都被覆盖＃。
＃注：所有的交配混合物可以镀在3个培养皿中。对于高效交配，应在电镀前进行稀释（1/10倍，最大1/100倍）。这些稀释液是用微量离心管中的无菌DPBS 1x补充有5％失配的FBS制成的。必要时，可以直接在-80°C下储存交配混合物。

将SP4琼脂平板在37°C下孵育3至5天＃。
＃注意：为防止培养过程中发生干燥，应将培养皿放在37°C的培养箱中密封的塑料袋中。

计算共轭频率
使用双筒放大镜（10x-63x），在每个选择性和非选择性SP4琼脂平板的10µl稀释点或300µl扩散液上计数菌落形成单位（CFU）（图2）。
计算在两个选择性标记（即Tet R和Gm R ）中生长的CFU除以在没有选择压力的情况下散布在SP4琼脂上的稀释斑点中获得的总CFU的交配频率＃。
＃注意：结合频率也可以表示为每个供体或受体细胞的转导结合体数目，方法是将两个选择标记中培养的CFU除以仅使用两个选择标记之一（供体的CFU）培养的CFU。收件人的姓名，请参见上面的注释）。

对于可靠和可再现的数据，至少应执行三个独立的实验。

挑选，克隆和储存转导结合体
用无菌的200 µl微量移液器吸头挑取菌落，并将其转移到1 ml的SP4液体培养基中，并补充2种适当的抗生素。
在37°C下孵育24至96 h ＃。
＃注意：在此阶段，转导结合剂可以直接储存在-80°C下。

为了确保转导结合体的克隆性，可以按照先前的描述（Rosengarten等，1994）进行三个连续的亚克隆步骤，最后的肉汤培养物通过0.22 µm孔滤器过滤，然后在-80°C下保存。

图2.代表无乳支原体交配程序的示意图。在此，作为一个例子，将无乳乳酸杆菌菌株5632（含有ICE的菌株，ICE +）与菌株PG2（ICE-）配对。交配之前，通过使用pMT85质粒将稳定的庆大霉素抗性基因（Gm R ，紫色）或四环素抗性基因（Tet R ，绿色）独立地标记到菌株中（Baranowski等，2010）。。将这些菌株的饱和培养物（≈10 9 CFU / ml）等比例混合（每个1 ml），轻轻离心，重悬于新鲜SP4培养基中，一起孵育。然后将混合培养物直接铺板在适当的选择培养基上，并将稀释液接种到选择和非选择板上以测定缀合频率。

验证推定的结合物
在4°C下以12,000 xg离心1 ml克隆的转导结合物培养物25分钟。
除去上清液，并向细胞沉淀中加入50μl裂解缓冲液（请参见“配方”部分）
在37°C下孵育1小时。
通过在95°C下加热10分钟来灭活裂解缓冲液中包含的蛋白酶K。
使用针对用于交配的亲本菌株中存在的抗性基因的特异性引物进行PCR扩增（表1）（Dordet-Frisoni等，2014）。为此，取2 µl裂解的转导结合物培养物，并使用标准Taq DNA聚合酶程序（此处为NEB的Taq DNA聚合酶）进行PCR 。
使用一组7个引物对（表2）顺时针覆盖无乳链球菌基因组并产生特定于无乳链球菌基因组的PCR片段（Dordet-Frisoni et al。，2014）或整个基因组，通过PCR鉴定跨共轭基因组骨架。测序（Illumina）（Dordet-Frisoni等人，2019）。

表1 。用于检测抗生素标记的寡核苷酸：退火温度和预期的PCR产物大小（bp）

顺序

Tm值

大小（bp）

Gm1 （庆大霉素）

ACATGAATTACACGAGGGC
55°摄氏度

401

Gm2 （庆大霉素）

GTTCTTCTTCTGACATAGTAG

55°摄氏度

IntMtet1 （四环素）

TGGCGTACAAGCACAAACTC

55°摄氏度

444

IntMtet2 （四环素）

GCAAAGTTCAGACGGACCTC

55°摄氏度

PuroF （嘌呤霉素）

GTTGCTGTTTGGACTACTCCTG

52°摄氏度

359

PuroR （嘌呤霉素）

CACCAAGTTCTAGGACCTTCAGG

52°摄氏度

表2.用于转导结合体分型的寡核苷酸：根据菌株而定的序列，退火温度和预期的PCR产物（bp）

顺序

无乳分枝杆菌菌株

Tm值

5632

PG2

4055

4867

14628

玛加02F

CGCCATTGAAGGAACTTGCTCC

52

946

0

946

946

946

玛加0220R

TATGCCTGCAGATCAGTCACCA

玛加0900F

ATGGCAATTGATTTACTCCC

55

1500

900

1500

1500

1500

玛加0900R

ATGATGTTGGCCGTATTTGG

MAG1560F

GCCGGTGCCCGGGTTAAT

55

0

1311

0

0

0

MAG1560R

TCGACACCGCATTTAGCAGCA

MAG2450F

AGGACGCTGTAGAGTTTGCAAAGAA

55

0

1500

0

0

0

MAG2450R

TACCACTAGCTGCCGCACCA

玛加3840F

GAAGCACTAAAATCAGGCAA

55

1223

1067

1223

1223

1067

玛格3840R

GCGGCAGCAGAGTTATCAAG

玛加4400F

CTCTGGCTACAGATTCATCA

55

490

607

490

490

0

玛格4400R

GGTGAACGAGAACAATCGCC

MAG5860F

ACCATTGAACTACATTTGCA

52

494

1318

0

nd

nd

玛佳6510R

AAAACCGCAGACCCAAATGGT

MAG5890R

ACATTGCGATGTAGCGGGAACAG

菜谱

SP4液体介质（用于1 L）
3.5克PPLO汤

10克胰蛋白p

5.325克杆菌蛋白ept

690毫升蒸馏水

pH 7.8（可通过添加NaOH 5 N溶液调节pH）

该混合物应在添加之前进行高压灭菌：

170毫升补充FBS（胎牛血清，无菌溶液）

50 ml CMRL 1066（10x，无菌溶液）

50 ml TC酵母菌酸酯（在H 2 O中为4％溶胶，过滤后为0.22 µm）

25毫升酵母提取物（15％，无菌溶液）

10 ml D-（+）-葡萄糖（溶胶在H 2 O中的含量为50％，过滤后为0.22 µm）

1克氨苄西林

4毫升酚红0.5％

10 ml丙酮酸钠（在H 2 O中为0.5 M溶胶，过滤后为0.22 µm）

SP4琼脂培养基
与SP4液体介质相同，但有一些修改

在高压灭菌之前，添加：

9克选择琼脂

高压灭菌后

不要添加酚红和丙酮酸钠

无乳分枝杆菌裂解缓冲液
1毫升Tris - HCl （1 M ，pH 8.5 ）

5微升吐温- 20

125 µl蛋白酶K 20 mg / ml

加入无菌超纯水至最终体积为10毫升

致谢

这项工作得到了法国国家资助研究机构（ANR）的Grant ANR09MIE016（MycXgene）的支持，并得到了INRA和ENVT的支持。该协议源自Dordet-Frisoni等人的著作。（2013和2019）。

利益争夺

作者指出，没有利益冲突

参考文献

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