材料和试剂
T75细胞培养瓶（Corning，目录号：CLS3275）
15 ml锥形管（Corning，目录号：CLS430791）
0.4 μ中号polyest ER的transwell插入物（VWR，目录号：734-1581）
聚赖氨酸涂层载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：10219280）。
ARPE-19电池（ATCC，目录号：CRL-2302）
Alexa Fluor 488山羊抗兔（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11034）
正常山羊血清（Sigma - Aldrich，目录号：G9023-10ml）
胶原IV（Sigma - Aldrich，目录号：C5533）
DMEM / F-12火腿（Sigma - Aldrich，目录号：D8437-500ML ）
胎牛血清（Sigma - Aldrich，目录号：F9665-500ML ）
青霉素链霉素（Sigma - Aldrich，目录号：P4333-100ML）
磷酸盐缓冲盐水（Sigma - Aldrich，目录号：D8662-500ML）
胰蛋白酶-EDTA（生物科学，目录号：25200-056）
正常人血清（Sigma - Aldrich，目录号：H4522-20ml）
ZO-1（Thermo Fisher Scientific，目录号：40-2200）
抗C5b-9（Santa Cruz Biotech，克隆ae11，目录号：sc58935）
Hoechst（Sigma - Aldrich，目录号：B2261-25MG）
MOWIOL ® 4-88 （西格玛- Aldrich公司，目录号：81381-50G）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Tris - H Cl （Thermo Fisher Scientific，目录号：10724344）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
NaOH （Sigma-Aldrich，目录号567530）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：x100-500ML）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号10378-016）
Mowiol 4-88（请参阅食谱）
PFA为4％（请参阅食谱）

设备

通风柜
血细胞计数器
-80°C冷冻室
4°C冰箱
镊子
生物安全柜ll级
热块
共焦激光扫描显微镜Axio Observer Z1倒置显微镜，配备Zeiss LSM 700 T-PMT扫描单元和40倍平面图。

程序

Transwell准备
外套0 0.4 μ米聚酯TR answell插入用100微克/ ml的在PBS中的胶原IV的吹打胶原蛋白的适当体积到的顶侧的transwell过滤器。
让transwell过滤器在细胞培养级生物安全柜中关闭盖子，使其风干。
从每个transwell过滤器中轻轻吸出其他胶原蛋白。
细胞接种前，将每个过滤器在PBS中清洗两次。

细胞接种ARPE-19
将ARPE-19细胞保存在T75细胞培养瓶中的DMEM / F-12 Ham中，其中含10％FBS和1％PS。细胞以80％汇合度传代（我们已使用它们直至传代30）。
从T75烧瓶中吸出培养基，并用5 ml无菌PBS洗涤细胞单层两次。
加入3 ml预热的胰蛋白酶并在37 °C下孵育5分钟，直到细胞开始分离。
加入3 ml DMEM F-12。
我们Ë 10 ml的stripette到吸6 ml的胰蛋白酶/媒体和冲洗T75的底壁以除去所有附着的细胞。
将细胞悬浮液转移到15 ml锥形管中。
205 × g离心5分钟沉淀细胞。
轻轻吸出媒体。
将细胞沉淀重悬于1 ml新鲜培养基中。
使用血细胞计数器计数细胞。
吸移管600 μ升的DMEM /含10个％FBS到的基底外侧面F-12火腿的transwell过滤器。
种子细胞以1.7的密度× 10 5细胞PE ř厘米2在上部的transwell在200室μ升的DMEM /含10个％FBS的F-12火腿，（transwell小表面积0.33厘米2每孔）。
两天后，用含1％FBS的DMEM / F-12更换介质。
每个星期，星期三和星期五更换介质4周（图2）。

图2 。在transwell滤膜上生长的RPE细胞的极化。A. RPE的示意图。极化的RPE细胞显示顶端微绒毛和ZO-1紧密连接蛋白表达。B.接种在跨膜过滤器的顶侧，并保持至少4周RPE细胞形成偏振光由下式定义ZO-1免疫组织化学在博所示单层日（C）ARPE-19细胞和（d）p rimary hfRPE细胞。比例尺= 20 µm 。

细胞接种原代人胎RPE（hfRPE ）细胞
将细胞麻烦博士提供。来自美国贝塞斯达的美国国立眼科研究所（NEI）的Arvydas Maminishkis以融合的P-0单层形式被接收（Maminishkis等，2006）。
将hfRPE细胞放入装有培养基的T25中。
接受后，从细胞单层吸出所有培养基。
加入5 ml新鲜培养基Alpha MEM（不含L-谷氨酰胺Lonza BE12-169F），再加上Pen / strep + L-谷氨酰胺，5％FBS。
铺板前，让细胞至少静置1天。
吸出细胞培养液。
用50 ml的PBS洗涤细胞。
ñ OTE ：牛逼他会充满整个瓶。

除去50 ml的PBS，重复进行第二步洗涤。
吸取5 ml温暖的胰蛋白酶-EDTA到烧瓶中。
将烧瓶放在培养箱中15分钟。
我们Ë脊椎穿刺针用3 ml的注射器，以吸出从RPE单层的胰蛋白酶。
将针的流动引导到带有粘附细胞的烧瓶壁上。
向下按压注射器以从烧瓶壁上流式清洗细胞。
我们Ë 5ml的吸量管向收集细胞悬浮液到无菌锥形管中。
立即将含有15％F BS的RPE培养基添加到锥形管中的细胞中。
再次重复步骤9-15，以确保所有细胞都被清除。
通过205 × g离心5分钟沉淀细胞。
轻轻吸出媒体。
将细胞沉淀重悬于1 ml新鲜培养基中（无需FCS）。
使用血细胞计数器计数细胞。
添加600 μ升RP的含有15个％FCS的每个的基底外侧孔E介质的transwell 。
种子细胞的密度100 × 10 3每厘米细胞2到心尖Transwell小在200室μ升含有15％FCS，RPE媒体的transwell小室表面积0.33厘米2每孔。
48小时后，从根尖和基底外侧transwell室抽吸培养基。
吸移管200 μ升含5个％FCS到顶端和600 RPE媒体的μ升到基底外侧室。
继续每个星期一，星期三和星期五更换RPE媒体4周。

验证紧密连接的形成
注意：紧密连接形成的验证可以与MAC形成分析同时进行。

4周后在培养的RPE细胞上的transwell插入物加入200固定μ升4％低聚甲醛（PFA）的至顶膜和600 μ升4％PFA的至基底外侧室。
在室温下将细胞在PFA中孵育1 0分钟。
轻轻抽吸PFA，注意不要在Transwell过滤器上戳孔或扰乱细胞。
洗涤细胞在过滤器上5分钟3次用200 μ升在顶部隔室的PBS和600 μ升的基底外侧面。
吸移管200 μ升或600 μ升0.05％的Triton X - 100分别插入到顶端和基底外侧腔室。
将细胞在室温下于0.05％Triton X - 100中孵育10分钟，以透化细胞膜。
吸取Triton X - 100。
吸移管200 μ升或600 μ升5％正常山羊血清（NGS）的在所述顶端和基底外侧分别室。
在室温下在NGS中封闭细胞1小时。
吸出5％NGS。
吸移管100 μ升ZO-1抗体（1：100 5％NGS）插入的顶侧的transwell过滤器。
100 μ升抗体的移液到一个空6的底部-孔板和所述的transwell插入物被直接放置在抗体坐。
将插入物在4 °C下孵育过夜。
从心尖腔抽吸抗体。
地方的transwell与600一个新板μ升在基底外侧腔和吸移管100的PBS μ升PBS进入顶侧。
重复此洗涤步骤3次。
吸移管100 μ升或600 μ升PBS与山羊抗-兔488（1：500）到顶端和基底外侧分别室。
孵育转孔中的第二抗体2 ħ一吨室温。
吸出二抗。
吸移管200 μ升或600 μ升分别PBS进入顶端和基底外侧腔室。
重复PBS洗涤3次。
吸出最后的PBS
加入200 μ升的Hoechst的（1:10 ，000）到心尖的transwell 。
孵育Transwell小为2分钟。
在PBS中将transwell洗涤3次。
轻轻地从Transwell过滤器中清除所有液体。
将transwell倒置在干净的表面上。
ģ ently ü小号Ë无菌手术刀来切割绕膜的周边上。
第一次切开后，用无菌镊子夹住过滤器的一侧。
继续用刀片缓慢切割时，请轻轻用镊子松开膜。注意不要用镊子刮擦细胞单层。
一旦膜被切开，用镊子将膜的基底外侧向下安装在聚赖氨酸涂层的玻片上。即，单元格应面向幻灯片顶部。
吸管50-100 μ升的的Mowiol ® 4-88安装媒体到膜上并与盖盖玻片。
MAC形成分析
在MAC形成分析之前48小时，从根尖和基底外侧transwell室中取出所有RPE培养基。
吸移管600 μ升无血清的DMEM / F-12火腿到基底外侧transwell小室中。
吸移管200 μ升无血清的DMEM / F-12火腿入到顶室。
在37°C时快速解冻普通人血清（NHS）的瓶装。
等分试样NHS成单次使用的等分试样（300-500 μ升）。
将等分的NHS储存在-80°C。
在MAC分析的当天，从-80°C除去两等分的NHS。
在冰上解冻等分试样。
通过放置在设定为56°C的加热块或水浴中，加热可灭活一份等量的NHS。
在56°C下孵育血清30分钟，每10分钟倒转一次试管。
让热灭活的血清冷却至室温。
指定哪些transwell将用于顶端或基底外侧的MAC形成。
从Transwell抽吸培养基。
添加600 μ升无血清培养基中的至基底外侧室和180 μ升无血清培养基中的被指定为心尖MAC评估井的顶室中。
添加540 μ升无血清培养基中的至基底外侧室和200 μ升无血清培养基中，以指定用于基底外侧MAC评估井的顶室中。
移液管20 μ升任NHS或热灭活（您好）HIN HS到含有180孔的顶室μ升的培养基。
移液管60 μ升任NHS或HiNHS到含有540孔的基底外侧室μ升的培养基。
将RPE与NHS或HiNHS孵育2-24小时。
后通过添加200 24个小时修复细胞μ升4％PFA的至顶膜和600 μ升4％PFA基底外侧室。
在室温下将细胞在PFA中孵育10分钟。
轻轻抽吸PFA，注意不要在Transwell过滤器上戳孔或干扰细胞。
洗涤细胞在过滤器上5分钟用200 3次μ升在顶部隔室的PBS和600 μ升的基底外侧面。
吸移管200 μ升或600 μ升血清白蛋白（BSA）到顶端和基底外侧腔室分别牛的5％。
在室温下在BSA中封闭细胞1小时。
吸取5％BSA。
吸移管100 μ升的C5b-9 MAC抗体（在5 1:25％BSA）到API的所述的卡侧的transwell过滤器。
100 μ升抗体的移液到一个空6的底部-孔板和所述的transwell插入物被直接放置在抗体坐，板带盖并用石蜡膜密封。
将插入物在冰箱中于4°C孵育过夜。
从心尖腔抽吸抗体。
地方的transwell与600一个新板μ升在基底外侧腔和吸移管100的PBS μ升PBS进入顶侧。
重复此洗涤步骤3次。
吸移管100 μ升或600 μ升PBS与山羊抗小鼠647（1：500）和鬼笔环肽（1：500）到顶端和基底外侧分别室。
孵育转孔中的第二抗体2 ħ一吨室温。
吸出二抗。
吸移管200 μ升或600 μ升分别PBS进入顶端和基底外侧腔室。
重复PBS洗了3次。
吸出最后的PBS
加入200 μ升的Hoechst的（1:10 ，000）到心尖的transwell 。
孵育Transwell 2分钟。
在PBS中将transwell洗涤3次。
轻轻地从Transwell过滤器中清除所有液体。
将transwell倒置在干净的表面上。
ģ ently使用无菌手术刀来切割绕膜的周边上。
第一次切开后，用无菌镊子夹住过滤器的一侧。
继续用刀片缓慢切割时，请轻轻用镊子松开膜。注意不要用镊子刮擦细胞单层。
一旦膜被切开，使用镊子将膜安装到聚赖氨酸包被的玻片上（Thermo Scientific）。
吸管50-100 μ升的的Mowiol  4-88安装媒体到膜上并与盖盖玻片。
使用共聚焦激光扫描显微镜对ARPE-19细胞（图3）和hfRPE细胞（图4）上的MAC形成进行成像。

图3 。在ARPE-19细胞上进行MAC分析。在CEP刺激的ARPE-19细胞中（诱导替代补体途径）和10％NHS作为补体来源24小时观察到MAC形成（红色）。在单独的NHS或H iNHS对照中均未观察到染色。比例尺= 20 μ米。

图4在hfRPE上的MAC分析。在用CEP和10％NHS刺激2小时的hfRPE细胞中观察到MAC形成（绿色）。仅在NHS或HiNHS对照中未观察到染色。比例尺= 20 μ米。

数据分析

使用配有Zeiss LSM 700 T-PMT扫描单元和40倍平面图的共聚焦激光扫描显微镜Axio Observer Z1倒置显微镜分析染色。

菜谱

Mowiol 4-88
2 .4克Mowiol

6克甘油

6毫升H 2 O

在室温下搅拌几个小时

加入12 ml 0.2 M Tris -H Cl（pH 8.5）并加热至50 °C 10分钟

离心机的Mowiol在5 ，000 ×克15分钟

分装并储存在-20°C

PFA 4％
将4 g PFA添加到50 ml H 2 O中
加入1 ml 1 M NaOH，在约60°C的加热块上轻轻搅拌直至PFA溶解
加入10毫升10 × PBS，让混合物冷却至室温
调节pH至7.4
用H 2 O调节最终体积至100 ml
通过0.45-μm的膜滤器过滤溶液以除去任何颗粒物
使PFA溶液在使用前新鲜，或等分保存在−20°C几个月
注意小号：

避免反复冻结/解冻。
制备PFA会释放出有毒烟雾，我们使用通风橱作为预防措施。

致谢

这项研究由美国BrightFocus基金会（M2016030 ），爱尔兰卫生研究委员会（HRB-HRA / 2013.290 ）和爱尔兰科学基金会（SFI 15 / CDA / 3497 ），皇家维多利亚州眼耳医院（RVEEH）资助，爱尔兰，国家儿童研究中心（NCRC），爱尔兰，爱尔兰研究委员会（IRCLA / 2017/295 ），爱尔兰。显示该方案的原始研究论文发表在细胞报告中（Mulfaul et al。，2020）。

利益争夺

作者没有金融或非金融竞争利益。

参考

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