材料和试剂

多通道移液器200μl + 200μl吸头
多分配器移液管1 ，000微升+ 1 ，000微升的提示
60 mm × 15 mm培养皿（Sigma，目录号：P5481）
细胞过滤网70μm或100μm尼龙（Falcon，目录号：352350或352360）
猎鹰锥形管（15 m l ，50 m l ）（猎鹰，目录号s ：352196和352070）
1米升无菌注射器（Fisher Scientific公司，目录号：15889142）
5米升，10米升，25米升移液管（VWR，目录号小号：612-3702，612-3700，和612-3698）
Eppendorf管1.5 m l
手术刀
封口胶卷
带细胞过滤器的荧光激活细胞分选（FACS）管（Corning，目录号：352235）
FACS管聚苯乙烯5米升圆底12 × 75毫米（康宁，目录号：352052）
UltraComp eBeads补偿珠（eBiosciences ，目录号：01-2222-42），小号撕4 ℃下
96孔V型/锥形底部平板（Sarstedt ，目录号：82.1583.001）
注意：或者，我们使用了圆底板，结果相似。

1 × Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（PBS）（无菌的，不含Ca ++和Mg ++ ）（GIBCO，目录号：14190144），小号撕在室温下
Hank氏平衡盐溶液（HBSS）（Gibco公司，目录号：14170112），小号撕4 摄氏
0.02％钠叠氮化物（Sigma，目录号：S2002），小号撕4 ℃下
牛血清白蛋白（BSA）的冻干粉末，适合于细胞培养物（Sigma，目录号：A9418），小号撕4 ℃下
RPMI 1640（GIBCO，目录号：21875034），小号撕4 ℃下
红细胞溶解（RBCL）缓冲液Hybri -Max（Sigma，目录号：R7757），小号撕在室温下
胶原酶IV（Sigma公司，目录号：C5138），小号撕在-20 ℃下
DNA酶我重组的，无RNase，10U /微升（罗氏，目录号：4716728001），小号撕在-20 ℃下
台盼蓝溶液（Gibco，目录号：15250061），小号撕在室温下
纯化的抗小鼠CD16 / CD32（Fc封闭）（Biolegend公司，目录号：101302），小号撕4 ℃下
僵尸红可定影活力试剂盒（Biolegend公司，目录号：423109），小号撕4 ℃下
真核转录因子缓冲器组（Biolegend公司，目录号：424401），小号撕在-20 ℃下
解离缓冲区（请参阅食谱）
含0.5％BSA的DPBS（或HBSS）（请参阅食谱）
10％叠氮化钠储备溶液（请参阅食谱）
冰冷的FACS缓冲液（请参阅食谱）
FACS抗体（请参阅表1）

表1.流抗体信息

设备

移液器（例如，移液器）
计数室载玻片或血细胞计数器
解剖工具（精细科学工具）
卡尺（用于测量肿瘤大小）（Fine Science Tools，目录号：30087-00）
BD LSRII流式细胞仪（BD，新泽西州富兰克林湖）
四激光设置：紫色（403 nm），蓝色（488 nm），黄色/绿色（561 nm）和红色（640 nm）。该协议是为在BD LSRII流式细胞仪上进行分析而编写的，但可以很容易地适用于任何4激光细胞仪。激光器的可用性以及用户细胞仪中反射镜的配置将决定可以使用哪些荧光染料。

摇床培养箱在37 °C
室温和4 °C的台式离心机（带平板适配器）
自动细胞计数仪（Invitrogen）或光学显微镜
带有96孔板适配器的台式涡流（可选）

软件

FlowJo （BD，版本10，https: //www.flowjo.com/ ）
GraphPad Prism（GraphPad，版本8，https://www.graphpad.com/）

程序

图1.协议主要步骤示意图

在开始之前：

准备解离缓冲液（见配方小号和注意事项如下图）。使用10米升每肿瘤（直径为0.6-1.2厘米），过滤它，并在37暖℃下（例如，在水浴）。打开37 °C的振荡器培养箱。解离缓冲液应在每次实验前新鲜制备。

动物安乐死必须按照当地动物保护和使用机构委员会（IACUC）的指示进行。

从乳腺肿瘤制备单细胞悬液（图1）
用卡尺测量肿瘤并记下肿瘤大小。
通过外科手术从小鼠身上取出肿瘤，并将其放置在无菌的60 mm × 15 mm培养皿中，该培养皿中装有3 ml冰冷的RPMI或冰冷的DPBS / 0.5％BSA。注意避免淋巴结被嵌入乳腺/肿瘤组织内。
使用两个手术刀将肿瘤切成1-2 mm 3的碎片（5-10分钟，取决于肿瘤的大小），然后将切碎的肿瘤倒入缓冲液中，放入15 ml锥形管中。
添加10米升预热解离缓冲液（配方1）的。
在摇床培养箱中于37 °C孵育30分钟。拧紧15 ml锥形管盖，并用封口膜包裹。每5分钟用5 ml移液管上下吸打，以破坏组织。
注意：样品应该是混浊的，但不能是丝状的。如果它是在该步骤拉丝，所述在解离缓冲液的DNase I浓度可以通过添加增加更多的DNase I溶液。

用5 ml移液管上下移液2分钟; 完全重悬细胞非常重要，因为红细胞倾向于附着在髓样细胞上。
离心300 ×克（1 ，200rpm）下10分钟，在室温下。
注意：不要离心速度高于300 ×如果有淋巴细胞工作摹因为他们是高G力敏感的小号。

吸出上清液并轻轻悬浮在10米粒料升的补充有0.5％BSA的DPBS（或HBSS）。
将100μm细胞过滤器直接放在新鲜的50 ml锥形管上。通过细胞过滤器过滤重悬的细胞悬液。从管中提起细胞过滤器，以使内容物通过。如果必要的话，R樱雪细胞滤网一旦与2 - 3米升的补充有0.5％BSA的DPBS（或HBSS）。
在室温下以300 × g （1200 rpm）离心10分钟。吸并丢弃的上清液。
[如果肿瘤细胞悬液不带血，则跳过步骤A 10- A 14]。将沉淀物重悬于2 ml的红细胞溶解（RBCL）缓冲液中。在室温下轻轻混合1分钟。
注意：待办事项不置于冰上细胞在此孵育步骤。

加入补充有0.5％BSA的20 ml DPBS（或HBSS）。
在室温下以300 × g （1200 rpm）离心7分钟。丢弃上清液。
注意：如果红细胞裂解不完全，从宏观上看是红色细胞沉淀，则重复步骤A10-A12。

将沉淀重悬于补充有0.5％BSA的20 ml DPBS（或HBSS）中。
在室温下以300 × g （1200 rpm）离心7分钟。丢弃上清液。
注意：该洗涤步骤是Ë nsure没有RBCL缓冲器保持小号于样品中。

将沉淀重悬于补充有0.5％BSA的1 ml DPBS（或HBSS）中。
将70μm细胞过滤器直接放在新鲜的50 ml锥形管上。通过细胞过滤器过滤重悬的细胞悬液。
注意：细胞趋于结块；因此，ê nsure你仔细悬浮细胞，并将其筛选计数之前。

计数细胞以使用锥虫蓝计算活细胞浓度。将细胞放在冰上或在4 °C下。

用于FACS分析的染色细胞群体（图1）
注意：使用冰冷的试剂/溶液并在4 °C （在冰上）上执行所有步骤；低温会阻止表面抗原的调节和内在化，从而降低荧光强度。

1.将细胞铺在96孔V型/锥形底平板中。每个孔应包含大约1 × 10 6个细胞。是一定要包括用于补偿单色彩控制（见图井URE例如2）。

2.在4 °C下以300 × g （1,200 rpm）离心细胞板4分钟。

3.轻弹培养板，弃去上清液。

注意：È nsure有在每个孔接种作为可见光粒料底部收集细胞。

4.将细胞重悬于含有Fc Block CD16 / CD32的50 µl冰冷FACS缓冲液中（1:50稀释，每孔浓度为0.5 µg）。

注意：此阻断步骤对于防止非特异性结合和背景荧光很重要。

5.在冰上孵育10分钟。

图2.九十- 6 -嗯板布局。Mix 1建议布局的示例，包括未染色，单一污渍和FMO控件。对于单色彩控制，补偿珠（例如，UltraComp eBeads ）都可以使用。必须对感兴趣的样品进行未染色和FMO对照，以说明自发荧光。单-颜色控制必须包含对于每种抗体荧光团使用/。

细胞表面染色：

6.当细胞在Fc区域中孵育时，用FACS缓冲液制备抗体溶液（请参见表1）。小号uggested antibod ÿ组合小号和稀释液（基于微升/孔的100总体积，50μl的Fc封闭+50μl的抗体混合物的）示于表2中所示，准备50μl的抗体混合物小号每个样品。

版权所有©20 21作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个

说明：logonew

表2.三种不同抗体组的建议

注意：抗体以50 µl溶液s的形式添加至最终总体积s为100 µl。因此，最终稀释度是所制备稀释度的一半。*细胞内抗体

版权所有©20 21作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个

说明：logonew

从这一步开始，将板放在黑暗和冰上。

7.加入50μl抗体溶液（表2）至所述适当的孔中（不需要洗FC挡掉所述细胞;井的总体积为100微升，以最终稀释因子小号表2所示）并用上下移液混合。在黑暗中和冰上孵育细胞30分钟。

8.对于流式细胞仪补偿，请准备未染色细胞的样品（对照孔）和细胞（或珠子）的样品，并用实验中使用的每种抗体-荧光团组合染色。在对照孔中那些不接受抗体，它是临界添加50微升FACS缓冲液，以避免让所述细胞干。补偿珠也可用于单细胞染色。我们建议使用UltraComp eBeads （遵循制造商的建议规程）。

9.洗涤细胞通过加入150微升的冰冷FACS缓冲液到每个孔中。

10.离心板与在300个细胞×克在4（1200 rpm）离心4分钟℃。

11.轻弹培养板，弃去上清液。洗涤2 ×用200μl的冰冷的FACS缓冲液。

细胞内（核）染色：

（如果不进行细胞内染色，则直接转到步骤B 23）

染色的FOXP3，细胞内抗原，我们使用了道道通核TM转录因子从染色缓冲Biolegend的，遵循荷兰国际集团由制造商提供的确切说明。如果该规程适用于细胞内细胞因子（例如IL-6）的染色，则可以使用其他试剂盒代替。

12.最后一次洗涤后，弃去上清液并轻轻涡旋样品（或上下吸液管）以解离细胞沉淀。

13.通过用固定液稀释剂（3份）稀释4倍固定液（1份），准备新鲜的True-Nuclear Fix工作溶液。

14.在每个孔中加入200 µl True-Nuclear 1 × Fix工作溶液。轻轻地上下移液以确保细胞完全重悬。在黑暗中于室温下孵育45-60分钟。

注意：较长的注视时间可以帮助减少高背景。

15.在室温下以300 × g （1200 rpm）离心平板4分钟。丢弃上清液。

16.用蒸馏水稀释10 × Perm Buffer，制备1 × Perm Buffer的工作溶液。

17.在每个孔中加入200 µl True-Nuclear 1 ×工作溶液的Perm Buffer。

18.在室温下以300 × g （1,200 rpm）离心平板4分钟。丢弃上清液。

19.使用True-Nuclear 1 × Perm Buffer重复步骤B14-B15两次，共进行3次洗涤。

20.向每个孔中加入在True-Nuclear 1 ×彼尔姆缓冲液中稀释的适量FOXP3抗体，并在室温下于黑暗中孵育至少30分钟。

21.向每个孔中添加200 µl真核1 ×彼尔姆缓冲液。重复St eps B15- B16。

22.将细胞重悬于150 µl冰冷的FACS缓冲液中。

23.将细胞转移到标记的12 × 75 mm聚苯乙烯试管中，并加入350 µl FACS缓冲液（以使最终体积为500 µl）。

24.获取关于流式细胞仪尽可能快地将样品（保持在细胞中的黑暗和在冰上或在4 ℃下）。我们通常会获得50万-每个样品750000的事件或细胞。

25.使用FlowJo或FACSDiva等软件分析数据。根据细胞表面分子的表达鉴定免疫细胞群（见表3）；图3显示了一个示例性的门控方案。

表3 。基于细胞表面标志物表达的免疫细胞群定义

图3.免疫细胞的示例性门控策略。首先，将肿瘤细胞绘制在前向散射（FSC）与侧面散射（SSC）图上，以区分完整细胞与碎片。然后，通过显示FSC面积（FSC-A）对FSC高度（FSC-H）的图来选择单个单元格。活/死细胞通过选择僵尸红低（活细胞）或高（死细胞）种群来区分。然后评估活的单个细胞中所选细胞表面标志物的表达（表3）。通过表达EpCAM，可以进一步将上皮来源的癌细胞与CD45 +细胞区分开。该图中的p个批次代表了Fein等人提供的数据。（2020 ）并经许可改编。

数据分析

流式细胞术实验的原始数据输出文件生成为.fcs。这些可以很容易地打开了的FlowJo软件（https://www.flowjo.com/）。

使用的门控策略如图3所示（改编自Fein等人，2020年）。

可以使用GraphPad Prism Version 8软件（https://www.graphpad.com/）进行统计分析。

图1和2是使用BioRender.com创建的。

笔记

使用单适当的补偿-色彩控制是必要的帐户渗出通过荧光比主信道之外的信道检测被测量为。补偿参数可以在通过流式细胞仪检测信号后或收集数据后自动“实时”计算（“离线”）。在此协议中，我们使用FACSDiva软件执行了“实时”补偿。
我们强烈建议使用荧光减一（FMO）控件。这是一种样品，除一种试剂外，所有试剂均已染色。通过对这些样品的分析，可以对荧光高于背景水平的细胞进行精确定义。例如，在骨髓面板1（表2）时，FMO对照将是1）的所有抗体减去CD45 ，2）所有抗体减去Ly6G，3）所有抗体减去CD11b的，依此类推（见图URE 2）。
首次使用新抗体时，也应使用同种型对照。同型对照是对靶标缺乏特异性但与一抗的种类和类型相匹配的一抗。它们被用来作为阴性对照，以帮助区分非特异性背景信号小号的特异性抗体信号小号。但是，同型对照不能替代FMO对照（Maecker和Trotter，2006; Cossarizza等人，2017）。
对于没有经验的用户，我们强烈建议您在计划实验之前与该机构的流式细胞仪核心经理进行讨论。

菜谱

解离缓冲液
胶原酶IV（终浓度2 mg / ml ）

RPMI中的DNase I 10U / ml （终浓度4 U / ml ）

对于10米升RPMI的，使用20mg的胶原酶IV + 4微升10单位的/ μl的DNA酶I

具有0.5％BSA的DPBS（或HBSS）
溶解2.5克BSA在500米升DPBS的
过滤溶液并将缓冲液保持在4 °C
10％叠氮化钠原液
将10克叠氮化钠溶于100毫升l蒸馏过的H 2 O中
制备1米升等分试样并储存在-20 ℃下
冰冷的FACS缓冲区（已过滤）
DPBS / 0.5％BSA /叠氮化钠0.02％w / v

保持在4 °C最多2个月。

注意小号：

使用不含Ca / Mg 2+的PBS。在一个这些离子的bsence减少阳离子依赖性细胞-至-细胞粘附和防止结块。
使用0.1％到1％的BSA。血清蛋白可保护细胞免于凋亡，防止非特异性染色并防止细胞粘连。
EDTA防止基于阳离子的细胞-细胞粘附，并且如果处理粘和贴壁细胞，如巨噬细胞应被包括在缓冲器中，并且如果这些细胞被以被分类为功能细胞培养物测定。在那种情况下，我们建议加入0.5-5 mM EDTA（最佳浓度应在实验中确定，以避免细胞毒性）。为了使用该方案表征免疫细胞浸润到肿瘤中，可以选择使用EDTA。
小号憎恨叠氮化物（0.01〜1％）在低浓度下减少了细菌污染，防止光致漂白，并阻止抗体脱落。应该确定最佳浓度以避免细胞毒性。如果要收集细胞进行功能测定，请勿使用叠氮化钠，因为它会抑制代谢活性。

致谢

作者要感谢冷泉港癌症中心支持补助金（CCSG，P30-CA045508 ）的共享资源，动物设施以及流式细胞仪的穆迪（P. Moody）。这项工作得到了西蒙斯基金会（Simons Foundation）向CSHL的资助。该协议改编自以前的工作（Fein等人，2020年）。

利益争夺

M. Egeblad持有Agios Pharmaceutical的股票，并已从MPM，CytomX和Insmed处获得个人费用，用于在提交的工作之外提供咨询服务。

伦理

所有动物程序和研究均由CSHL的机构动物护理和使用委员会批准，并根据《 NIH实验室动物的护理和使用指南》（ID 18-15-12 -09-6，于2018年7月生效）进行到2021年7月）。该协议是从Fein等人修改而来的。（2020）。

参考

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