材料和试剂

移液器吸头（已过滤）（Thermo，目录号：TF112-1000-Q，T104RS-Q，TF140-200-Q）
0.2 ml PCR管（Thermo，货号：431-MIXED-Q）
1.5 ml微型管（AXYGEN，目录号：MCT-150-LC）
50毫升试管（猎鹰，货号：352098）
96孔板（Corning，目录号：3599）
24孔板（Corning，目录号：3524-ND）
6孔板（Corning，目录号：3516）
10厘米盘子（Corning，货号：430167）
pC0040-LwaCas13a crRNA主链（Addgene ，目录号：103851）
pB-CAGGS-dCas9（Addgene ，目录号：110823）
超级PiggyBac转座酶（SBI，目录号：PB210PA-1）
DMEM（生命，目录号：C11995500CP）
FBS（Gemini，目录号：100-307）
青霉素-链霉素（生命，目录号：15140122）
Opti-MEM（Gibco，目录号：31985062）
PEI（Polysciences ，目录号：23966）
PBS（生活，货号：C20012500CP）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（生命，目录号：25200072）
生物素（SCRC，目录号：67000260）
的Triton ® X-100（生工生物，目录号：T0694-100毫升）
1的1M Tris pH值7.5，无菌（生工生物，目录号：B548127-0500）
100×蛋白酶抑制剂混合物（Biotool ，目录号：B14001）
脲（生工生物，目录号：UT0907）
DTT（MDBio ，目录号：D023-5G）
碘乙酰胺（SIGMA，货号：I1149-5G）
链霉亲和素磁珠（PIERCE，目录号：88816）
的1M Tris pH 8.0中，无菌（生工生物，目录号：B548127-0500）
的NaCl（生工生物，目录号：A501218-0001）
SDS（MDBio ，目录号：S001-100）
EDTA（生工生物，目录号：E0105-500g）
碳酸氢铵试剂plus（R）（Sigma，目录号：A6141-500G）
RapiGest SF（Waters，货号：186008090）
测序级修饰胰蛋白酶（Promega，目录号：V5113）
甲酸（Sigma，目录号：94318-250ML）
乙腈（Merck Chemicals，目录号：1.00030.4008）
三氟乙酸LC-MC Ultra（Sigma，目录号：14264-50ML）
CRUIS和BioPupE的氨基酸序列信息可在https://doi.org/10.1093/nar/gkaa143获得
ZIPTIP C18（密理博，目录号：ZTC18S960 ）
抗MYC抗体（Cell š ignaling，目录号：2276s）
山羊一个nti-米乌斯IgG抗体（H＆L）[HRP（金斯瑞，目录号：A00160）
链霉亲和素-HRP（小区š ignaling，目录号：3999s）
BSA （AMRESCO ，目录号0903-5G ）
SurePAGE （金斯瑞，目录号：M00657 ）
PVDF西方b印迹膜（罗氏，目录号：30100400 ）
Bbs I -HF（NEB，货号：R3539 ）
裂解缓冲液（请参见食谱）
缓冲区1（请参阅食谱）
缓冲区2（请参阅食谱）
缓冲区3（请参阅食谱）
缓冲区4（请参阅食谱）

设备

标准分子生物学实验室设备
Eppendorf搅拌机（Eppendorf，目录号：5382000074）
磁性小号eparator（Bimake ，目录号：B23803）
-80°C冰箱（Therom ，目录号：905）
FACSAria TM III（BD）
反式- b很多吨urbo（Biorad公司，目录号：1704150）
化学发光成像系统（GE，Amersham Imager 600）
真空浓缩器（Thermo，SpeedVac ）
光谱仪（Thermo，Orbitrap Fusion）

程序

分子克隆：D ESIGN和组装为靶基因因组表达载体，亚克隆CRUIS成的质粒用于产生稳定细胞系

对于sgRNA表达载体

设计sgRNAs的靶基因。w ^ ê建议设计与CRISPR-RT。可以将参数设置为crRNA的靶互补区的长度为28 nt ，种子区的长度为10 nt （CRISPR-RT的默认参数）。系统将提供一系列crRNA，如果您对目标RNA的特定区域感兴趣，则可以选择针对相应位置的crRNA。欲了解更多信息和指南，请按照链接到CRISPR-RT（http://bioinfolab.miamioh.edu/CRISPR-RT/interface/C2c2.php）（朱等人，2018 ）。
通过将退火的寡核苷酸插入由BbsI消化的LwaCas13a -DR和poly-T之间基于U 6启动子的表达载体中克隆的sgRNA表达质粒（对于正向寡核苷酸应在5'中添加AAAC，反向寡核苷酸应在5'处添加AAAA作为插入被BbsI消化的LwaCas13a crRNA主链的开销。为了通过退火寡核苷酸克隆将gRNA克隆到质粒中，我们建议使用Addgene提供的方案作为参考（http://www.addgene.org/protocols/annealed-oligo-cloning）。
注意：任何带有LwaCas13a crRNA的质粒都适用，这里我们以pC0040-LwaCas13a crRNA骨架（Addgene ＃103851）为例。

F或用于构建稳定细胞系的质粒

将CRUIS-P2A-EGFP克隆到限制性酶切位点NheI和HpaI之间的pB-CAGGS-dCas9载体的骨架中。
注意小号：

任何PiggyBac表达载体都是合适的，这里以pB-CAGGS-dCas9（Addgene ＃110823）为例，CRUIS-P2A-EGFP的序列信息可在https://doi.org/10.1093/nar/gkaa143获得。
在邻刻申到便于下面的描述中，我们使用CRUIS，其是方法“的名称来表示dCas13-PAFA融合基因; 并使用293T-CRUIS代表稳定表达dCas13-PafA的293T细胞。
制备无内毒素质粒，用于随后的PEI转染。

293T - CRUIS稳定细胞系的产生
注意：可被用于构建任何方法一个稳定的细胞系是合适的。我们更愿意推荐的慢病毒转染系统。CRUIS的大小约为5k bp，接近慢病毒载体的上限。如果需要引入一些选择标记，建议使用PiggyBac系统。

在37 ％10％FBS的DMEM中培养293T细胞在5％CO 2中为°C。
转染前一天，种子5 × 10 5细胞/孔，一个孔的一个6孔培养皿用2.5ml培养基。
当细胞生长至70％细胞融合时，通过PEI与PB-CRUIS-P2A-EGFP和Super PiggyBac转座酶（SBI：PB210PA-1）共转染293 T细胞，遵循步骤B4-B6 。
稀1.5 μ克PB-CRUIS-P2A-EGFP质粒和1.5 μ克超级piggyBac转转座的质粒在125微升的Opti-MEM ，稀7.5微升1毫克/毫升的PEI在125微升的Opti-MEM。
将稀释的质粒和PEI在1.5 ml试管中混合，在室温下孵育20分钟。
滴加PEI-DNA复合物到细胞中。
转染三天后，通过流式细胞仪分选EGFP阳性细胞以进行连续培养。
注意：此步骤是为了筛选成功转染的细胞；对于分选，野生型的293T细胞瓦特ERE用作对照。

十转染后的天数，EGFP阳性细胞分选入96 -孔板1个细胞/孔的单克隆选择。
注意：此步骤的目的是筛选出具有CRUIS-P2A-EGFP稳定表达的细胞。

分选三周后，选择了10个EGFP阳性克隆进行进一步扩增。
Western Blot用于测试每个克隆中CRUIS的表达。1个是百万细胞收获，用冷PBS洗涤，并在裂解2 00 μ升裂解缓冲液补充有1 ×蛋白酶抑制剂在冰上1个小时。甲压脚提升离心13 ，000 RCF ，150 μ升上清液中混合与30 μ升6 ×蛋白加载缓冲液和变性d在100 ℃下进行10分钟。20 μ升样品被加载到4-20％SDS-PAGE凝胶上，然后免疫-B很多婷用抗MYC抗体（1：3 ，000稀释的）来检测的表达CRUIS 。
到t EST的接近贴标活性CRUIS的在那些克隆稳定表达荷兰国际集团CRUIS 。细胞是在与的pcDNA3.1-生物PupE转染一个由PE 6孔板I.
Ť welve ħ我们的转染后，补充新鲜的培养基在20的最终浓度的生物素μ中号（为了方便起见，生物素被制备成100×DMEM中浓缩储备，并保存在4 ℃）
加入生物素24-48小时后，细胞被收获，并进一步检查PAFA活性，通过生物素信号指示对蛋白印迹分析。Ť与他细胞克隆高酶活性（具有强生物素信号小号）将被选择用于将来的实验。
注意：西方人用于检测生物素的封闭剂为5％BSA，因为最常用的牛奶基封闭剂含有生物素并导致本底。

细胞中的CRUIS标记
制备20个百万个细胞在一150毫米盘作为所述实验组，另一个作为所述对照组。
注意：所需细胞的数量取决于靶RNA的丰度。更多的细胞通常会产生更好的结果。

当CRUIS细胞达到约70％融合时，可通过PEI用sgRNA和pcDNA3.1-Bio-PupE质粒进行c -o转染。的共转染非靶荷兰国际集团因组和pCDNA3.1-生物PupE用来作为对照（因组的比率和pCDNA3.1-生物PupE为1：1，共15 μ克）。
Ť welve小时转染后，在20的最终浓度含有生物素的新鲜培养基替换μM 。
加入生物素24-48小时后，细胞被收获，洗涤用冷PBS 3次，贮存或裂解的质谱分析样品制备。

质谱制备
第一天

1.裂解约30亿个细胞通过2毫升裂解缓冲液以1×蛋白酶抑制剂在4℃下振荡一小时。

2.通过在13离心澄清裂解物，000 RCF 10分钟在4℃下。

3.转移9 00微升上清液至1.5mL微管，在添加576毫克尿素至约8 M的最终浓度（终体积为约1.2毫升）。

4.添加1 2微升的1M DTT至10mM的终浓度，然后裂解物孵育1个小时在56℃。

5.款待裂解物与30微升的1M碘乙酰胺至25mM的终浓度，孵化在黑暗在室温下45分钟到氨基羰修改的Cys蛋白质的位点。

6.添加30微升的1M DTT至25mM的终浓度，在室温下孵育30分钟以终止改性。

7.取50个微升链霉亲和磁珠（股票在含有PBS 0.1％BSA，0.05％的NaN 3和0.05％吐温20）至1.5mL微管中，把微管上的磁性支架为3分钟，在室温下，然后删除与该上清液移液管和洗涤珠三次用500微升PBS，然后重悬珠子用50 μ升裂解缓冲液。

8.将珠子转移到裂解物中，并在4°C的旋转器上孵育过夜。

第二天

9.温育后，将微管置于磁力架中3分钟，然后吸出裂解物，并在Eppendorf混合器上逐步用以下四个缓冲液洗涤珠子。

10.向每个微管中添加1 ml缓冲液1，并在Eppendorf混合器上于室温以600 rpm摇动5分钟。

11.将微管放入磁力带中3分钟，然后吸出缓冲液1。

12.重复小号TEPS D10和D11为一次。

13.加入1ml缓冲液2至每个微管，并在600rpm下摇动的Eppendorf上混合器，在室温5分钟温度。

14.将微管放入磁力带中3分钟，然后吸出缓冲液2。

15.向每个微管中添加1 ml缓冲液3，并在Eppendorf混合器上于室温以600 rpm摇动5分钟。

16.将微管放入磁力带中3分钟，然后吸出缓冲液3。

17.重复小号TEPS D15 D16和一次。

18.向每个微管中加入1 ml缓冲液4，并在室温下在Eppendorf混合器上以600 rpm摇动5分钟。

19.将微管放入磁力带中3分钟，然后吸出缓冲液4。

20.重复小号TEPS D18 D19及两次。

21.重悬珠子由100微升缓冲液5并加入6微克胰蛋白酶，将混合物转移到新的PCR管中，并在37℃下摇动样品过夜。

第三天

22.孵育后，将试管置于磁力架中，并将上清液转移至新的PCR试管中，并通过添加8μl10 ％甲酸将样品的pH调节至低于3 （在正常情况下，样品的p H低于3，可以通过PH纸测试）。

23.洗涤Ziptip用100微升100％ACN （乙腈）用移液管。

24.用移液管缓慢吸出ACN 。

25.余额Ziptip用100微升0.1％TFA （三氟乙酸）与移液管。

26.重复步骤D25一次。

27.用移液管小心地将肽与Ziptip结合3次。

28.脱盐肽用100微升0.1％TFA。

29.重复步骤D28一次。

30.通过添加50μl70 ％ACN -0.1％TFA将肽洗脱到新的1.5 ml微管中。

31.重复步骤D30两次。

32. SpeedVac浓缩器中的干肽。样品可以存储在-80°C或在Orbitrap Fusion上进行分析。

菜谱

裂解缓冲液
1％的Triton X-100

50 mM Tris pH 7.5，无菌

150毫米氯化钠

注意：P事先准备好并储存在4 °C下。

缓冲区1
50 mM Tris pH 8.0，无菌

8 M尿素

200毫米氯化钠

0.2％SDS

注：P事先准备好并在室温下保存）。

缓冲区2
50毫米Tris 8.0

200毫米氯化钠

8 M尿素

注意：P事先准备好并在室温下保存。

缓冲区3
50毫米Tris 8.0

0.5毫米EDTA

1 mM DTT （储存在-80°C ）

注意：P预先制备并在室温下保存，使用前将DTT加入终浓度为1 mM 。

缓冲区4
50 mM碳酸氢铵

注意：P事先准备好并在室温下保存。

缓冲区5
100 mM碳酸氢铵和1 mg / ml RapiGest

注：P repared 100mM碳酸氢铵H中2 ö提前，并储存在室温下，加入RapiGest至终浓度为1mg / ml使用之前。

参考

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